作者：William Finnigan et al.
发表日期：2019年11月
发表期刊：ChemCatChem
研究背景
多步酶促反应可以提供可观的经济价值和生产力。进程模型可以提供一个路径来理解这些复杂的反应并优化。
羧酸还原酶CARs是生物催化中很热门的酶，它可在温和的条件下将羧酸还原成醛类，并且可以在代谢途径中连接多个反应步骤。许多氧化还原酶需要辅因子，最常见的是NAD(P)H，生物催化中可以经济的将辅因子再生系统构建进去，比如磷酸脱氢酶PTDH。
ATP的再生需要丙酮酸激酶PK，肌酸激酶CK，腺苷酸激酶AK，多磷酸激酶PPK等，这些酶可以利用最便宜的多磷酸盐作为底物，多磷酸盐也可以是多磷酸盐-AMP磷酸转移酶PAP的底物，它可以将AMP转化为ADP，将PAP和PPK组合使用可以完成AMP到ATP的生物转化。
本作展示了构建七个酶的酶促反应与性质测试，三步生物催化反应。好的数学建模可以避免生物通路的实验错误，验证模型可以有助于实现去除实验瓶颈，识别错误行为，并使用遗传算法优化整个实验过程。实验验证了复杂的需要借助辅因子的七个酶催化反应可以使用可靠的建模与优化。
实验方法
4-甲基苯甲酸酯生物合成4-甲基苯乙醇的7个关键酶mpCAR，PTDH，tnAK，tnPAP，ttPPiase，apADH，afEst2 的纯化路线:
分别在E.coli中构建关于生物转化methyl 4-toluate到4-toluic acid到4-tolualdehyde再到4-tolylalcohol代谢途径的7个关键酶mpCAR，PTDH，tnAK，tnPAP，ttPPiase，apADH，afEst2的7个关键酶和tePPK酶，融合his-tag标签表达。
分别超声裂解细胞，20000 g在4℃离心30 min，前处理取上清。
使用1 mL HisTrap FF crude进行his-tag亲和捕获，缓冲液为25 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 M NaCl，10 to 250 mM imidazole梯度洗脱。
然后使用Superdex 200 HiLoad 16/60 分子筛进行精细纯化，缓冲液为25 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 M NaCl，流速1.0 mL/min。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 11000458 | HisTrap FF Crude | 5 x 1 mL |
| 预装柱 | 28989335 | HiLoad16/600 Superdex 200 pg | 1 x 120 mL |
| 填料 | 17531801 | Ni Sepharose 6 FF | 25 mL |
| 填料 | 17104301 | Superdex 200 pg | 150 mL |
| 空柱 | 28988946 | Column XK 16/70 | 16/70 |
