作者：Tatsuro Shimamura et al.
发表日期：2021年7月
发表期刊：Nature
研究背景
组胺是一种生物胺，是各种生理和病理生理条件下的重要介质，例如唤醒状态、过敏和炎症。组胺通过激活属于G蛋白偶联受体 (GPCR) 超家族的四种不同的组胺受体 (H1、H2、H3 和H4) 发挥其作用。组胺H1受体 (H1R) 最初是从牛中克隆出来的 ，现在已知在各种人体组织中表达，包括气道、肠和血管平滑肌和大脑 。在I型超敏反应中，H1R被肥大细胞释放的组胺激活，这些组胺受到各种抗原的刺激。已经进行了许多研究以开发H1R拮抗剂，通常也称为抗组胺药。其中许多化合物抑制组胺对H1R的作用以减轻过敏反应的症状，从批准的药物数量来看，使H1R成为最有效的药物靶点之一。H1R显示组成型活性，H1R拮抗剂通常作为H1R7,8的反向激动剂。H1R拮抗剂的开发经历了两代人的发展。第一代药物如吡拉明和多塞平是有效的H1R拮抗剂。然而，已知这些化合物显示出相当大的副作用，例如镇静、口干和心律失常，因为它们可以穿透血脑屏障 (BBB)，并且受体选择性低。这些H1R拮抗剂不仅可以与H1R结合，还可以与其他胺能GPCR、单胺转运蛋白和心脏离子通道结合。第二代药物如西替利嗪和奥洛他定的镇静作用较小，通常副作用较少。第二代两性离子药物的药理学改进可归因于新的羧基部分，与质子化胺结合，可显着降低脑通透性，但仍有报道称残留的中枢神经系统作用。羧基部分的引入也提高了这些化合物的H1R选择性，但某些第二代H1R拮抗剂，如特非那定，由于与心脏钾通道的相互作用，仍显示出心脏毒性 。
实验方法
H1R-T4L在酵母毕赤酵母中表达，H1R-T4L-GFP和Doxepin的膜蛋白复合物制备：
H1R-T4L-GFP解冻与5 mM Doxepin、10 mg/mL碘乙酰胺和不含EDTA的蛋白酶抑制剂下在冰上孵育30分钟；添加去垢剂：将2-3mg/mL膜悬浮液倒入含有20 mM HEPES pH 7.5，500 mM NaCl，1% (w/v) DDM，0.2% (w/v) CHS，20% (v/v) 甘油，并在 4℃下轻轻搅拌1-2小时。离心取上清。
捕获：
Ni-Sepharose HP重力柱
平衡：20CV，20 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl、10% 甘油、0.025% (w/v) DDM、0.005% (w/v) CHS、500 μM Doxepin和20 mM洗脱：3CV，20mM HEPES pH 7.5，500 mM NaCl，10%甘油，0.025% (w/v) DDM， 0.005% (w/v) CHS，1 mM Doxepin和500 mM咪唑。
酶切：
用带有His标签的TEV蛋白酶与样品反应后，通过Ni-Sepharose HP重力柱。样品流穿，用100 kDa Vivaspin浓缩管，将样品浓缩至30-40 mg/mL。
精纯：
Superdex 200去除聚集体。
通过脂质立方相 (LCP) 方法进行受体结晶：
蛋白质-LCP混合物含有40% (w/w) 受体溶液、54% (w/w) 单油精和6% (w/w) 胆固醇。晶体在 40-50 nL载有蛋白质的LCP丸剂中生长，覆盖有0.8 μL沉淀剂溶液 (26-30% (v/v) PEG400、300 mM 磷酸铵、10 mM MgCl2、100 mM柠檬酸钠 pH 4.5和1 mM多塞平）在 20 ℃。晶体直接从LCP基质中收获，并在液氮中快速冷冻。 X射线衍射数据在 100 K下以10 × 10 微米的光束尺寸在Diamond Light Source (UK) 的微聚焦光束线 I24 上收集。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28989335 | Hiload 16/600 Superdex 200 pg | 1 × 120 mL |
| 填料 | 17526801 | Ni Sepharose HP | 25 mL |
| 空柱 | 28964441 | HiScale 16/20 | 16/20 |
| 超滤管 | 28932363 | Vivaspin 20, 100 kDa MWCO PES | 12个 |
