作者：Chen F, et al.
发表日期：2021年8月
发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

研究背景

聚合酶相关因子复合物 (PAF1c) 由5个核心亚基Paf1、Leo1、Ctr9、Cdc73、Rtf1组成。越来越多的研究证明PAF1C能调节Pol II转录多个阶段，例如转录起始、启动子近端的暂停及释放、延伸、RNA加工/终止。PAF1C也参与维持异染色质和小的RNA介导的基因沉默或基因激活。而且PAF1C参与其他的细胞功能，包括DNA修复、信号转导、转录本的核输出、细胞循环调节、干细胞多能性的维持、自体吞噬、肿瘤发生。重要的是，PAF1C通过调节几个重要的组氨酸的修饰，进而介导大多数功能。PAF1C为Rad6/Bre1介导的组蛋白H2B泛素化所必须，但其对H2Bub泛素化的贡献的分子机制还未可知。

作者通过体外重组的方式表达了PAF1c相关因子，利用HisTrap HP 5 mL及HiLoad 26/60 Superdex 200纯化Ctr9 (1–972) /Paf1 (1–103) /Cdc73 (155−211) 融合蛋白，通过pull-down及SEC验证出Ctr9 (1–972) /Paf1 (1-103) /Cdc73 (155−211) 能够与含有C末端尾的完整的Rad6互作。因此Rad6的C末端氨基酸尾与维持酵母体内正常的Rad6介导的H2Bub水平有关。

实验方法

Ctr9 (1–972)、Paf1 (1–103) 克隆到修饰后的pETDuet-1。N端含有RBS的Cdc73 (155−211) 克隆到修饰后的pET32a上，之后将质粒转化到BL21 (DE3) -pUBS520 E.coil，37℃培养E.coli，直至OD600nm=1.0。将培养温度降低为16℃，利用0.3 mM IPTG，诱导E.coli表达目标蛋白。当诱导时间为16-18 h时，4000 rpm离心20 min，获得菌体沉淀。向沉淀中添加50 mM Tris-HCl，pH 8.0，400 mM NaCl，10 mM 咪唑重悬， AH-1500高压细胞匀浆机裂解，并收取上清。

首先，利用HisTrap HP 5 mL的镍柱捕获含有His标签的重组Ctr9/Paf1/Cdc73。之后利用HiLoad 26/60 Superdex 200根据分子量的差异性对镍柱洗脱物进行二次纯化，获得含有单一目标分子的组分。

为了进行后续的功能探索，利用PreScission酶孵育切除掉目标物上的Trx-his6标签。然后利用HiTrap Q HP 16/10及Superdex 200 10/300 increase纯化酶切后的反应产物，获得标签去除成功的目标分子 。

SDS-PAGE验证样品纯度，发现纯化后组分含有三种蛋白，完整性较好且纯度较高，可用于后续功能探索。PAF1C为Rad6/Bre1介导的组蛋白H2B泛素化所必须的组分，但是相关分子机制未知。将PAF1与RAD6/PAD6 (1-149) 于50 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM DTT缓冲液中，4℃条件下进行混合孵育 。利用Superdex 200 10/300 increase及Pull down分析PAF1复合物与RAD6的互作情况。结果发现在低盐缓冲环境中 (100 mM NaCl)，完整的RAD6能够与Ctr9 (1–972) /Paf1 (1–103) /Cdc73 (155−211) 发生互作，而PAD6 (1-149) 不能够与Ctr9 (1–972) /Paf1 (1–103) /Cdc73 (155−211) 复合物发生互作，因此 RAD6的C末端区域可能与其介导的PAF1C相关泛素化功能相关。这为揭示PAF1C参与组蛋白H2B泛素化的分子机制奠定基础。

产品信息

Reference
Chen F, et al. Biochemical insights into Paf1 complex-induced stimulation of Rad6/Bre1-mediated H2B monoubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Aug 17;118(33):e2025291118.