作者：Yagi H, et al.
发表日期：2021年12月
发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

研究背景

糖酵解在能量生产和代谢稳态中扮演着重要的角色。细胞内ATP/ADP控制着糖酵解通量；但是每个糖酵解酶催化反应进而控制通量的调节机制仍然未知 。磷酸甘油酸激酶 (PGK) 催化可逆的转磷酸反应，这能够在下一个糖酵解的平衡阶段直接产生ATP。尽管存在广泛的PGK表达的转录调控的研究，但是ATP/ADP比率的变化仍然模糊的。本文作者报道了一个hPGK利用配体腺嘌呤核苷酸和3-磷酸甘油酸脂结合协同进行蛋白水平调节的故事。

作者通过体外重组的方式表达了hPGK (人磷酸甘油酸激酶)，利用GSTrap、Superdex 200、Mono Q根据亲和性、分子量、带电荷差异性分离纯化获得目标分子hPGK。最终利用ITC及全面的CS适应性分析证明了MgAMPPNP和3PG协同相互作用后对于hPGK亲和性的影响。

实验方法

将hPGKs克隆至pGEX-6P-3质粒上，转化BL21，37℃培养，随后添加50 mg/mL α-D丁酮酸。当OD600nm=0.6时，添加1 mM IPTG，24℃过夜诱导，并离心收集菌体。利用20 mM Tris-Cl (pH 8.0)，200 mM NaCl，2 mM DTT，重悬，超声破碎，离心收取上清。将收取的上清液进行分离纯化。

首先，使用GSTrap层析柱捕获重组标签的GST标签蛋白，利用还原型谷胱甘肽洗脱获得GST-hPGK，并在4℃利用Prescission酶切，进而去除GST标签，利用GSTrap层析柱获得标签去除成功的hPGK。然后利用Superdex 200根据目标分子与杂质分子量的差异性进行二次分离。最后，利用Mono Q进行精细分离，获得纯净的hPGK分子。

将获得的产物进行ITC及全面的CS适应性分析。全面的CS适应性分析俩个配体MgAMPPNP、3PG结合的协同性，结果显示α值是1.36。与另一配体不存在时相比，协同后自由能减少了∼0.8 kJ/mol，暗示MgAMPPNP和3PG协同作用后与hPGK的亲和性是增加的。因此在生理盐浓度条件下，二者间协同作用使得亲和性有效增加，ITC实验获得同样的结果。

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Reference
Yagi H, et al. Molecular mechanism of glycolytic flux control intrinsic to human phosphoglycerate kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Dec 14;118(50): e2112986118.