作者：Piyachat Roop-ngam et al.
发表日期：2012年7月
发表期刊：Biochemical and Biophysical Research Communications
研究背景
草酸钙calcium oxalate (CaOx) 是肾结石的主要晶体成分，研究表明肾结石的形成可能与肾脏中草酸结合蛋白有关。通过EAH Sepharose 4B预活化填料偶联上草酸分子，可以从肾脏组织匀浆液上清中垂钓出与草酸结合的蛋白，通过双向电泳和质谱技术，进一步鉴定蛋白的序列和名称，确定是否参与结石过程。 利用2-DE双向电泳技术，结合阴性对照，找到了38个可以结合草酸的蛋白。经过Q-TOF MS质谱鉴定出共有28个unique 蛋白。通过PRATT tool比对工具，找到了L-x(3,5)-R-x(2)-[AGILPV]的氨基酸序列为草酸结合结构域。
实验方法
用0.24 g的草酸分子用3.6 ml的50% (w/v) dimethylformamide 溶解，与3 mL的EAH-Sepharose 4B填料进行偶联，将猪的肾脏组织，切成薄片后用PBS进行清洗，在用液氮速冻后，进行研磨成粉末，粉末用Tris pH 6.5溶解后用12000 g离心5min取上清液。含3 mg总蛋白的组织上清液用偶联了草酸的预活化填料进行垂钓，在用10 mM MES pH 6.5，150 mM NaCl，2 mM MgCl2，2 mM CaCl2，5 mM KCl清洗非特异结合的杂质后，用10 mM MES pH 6.5，150 mM NaCl，2 mM MgCl2，2 mM CaCl2，5 mM KCl，1 M NaCl，1 mM oxalic acid 洗脱下来。同时做一组阴性对照，即用没有偶联草酸的预活化填料同时进行一次垂钓步骤。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 填料 | 17056901 | EAH Sepharose 4B | 50 mL |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/20 |
