作者：Mojtaba Hedayati Ch et al.
发表日期：2016年9月
发表期刊：Journal of Molecular Recognition
研究背景
核酸适配体Aptamers可以是核酸或者多肽分子，具有三级结构对目标物具有极为特异的亲和力，因其耐受各种还原剂、广泛的pH范围和温度，不会聚集，生产成分低无需细胞培养，具有多种化学修饰等潜在的可塑性，较低的免疫原性。Aptamers一般从核酸库筛选，核酸库含有约~1015种RNA、单链和双链DNA，通过systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX技术筛选出能够特异性的结合目标物的核酸适配体分子。金黄色葡萄球菌作为一种人体致病菌，其产生的肠毒素staphylococcal enterotoxin B (SEB) 能够介导食物中毒和呼吸感染，通常的SEB体外检测利用的是血清型蛋白抗体的检测，通过将SEB偶联到预活化填料上，筛选出具有特异性较高亲和力的aptamer。 最终筛选出的SEB C3 aptamer，对SEB具有极高亲和力kd = 2.3 × 10-11，能够在100 μL人体血清中有效的检测出低至5 ng的SEB。
实验方法
构建的DNA文库包含的DNA的核心区域为40 nt的随机序列，两端各具有20 nt的引物序列。
将SEB纯品 1 mg/mL，与CNBr-Sepharose 4B 填料偶联。
通过Thermal and asymmetric PCR制备出一定含量的ssDNA 文库，将6 nmol 的ssDNA用300 μl结合缓冲液在37度溶解500 mM NaCl，100 mM NaHCO3，pH 8.2，然后在95度变性2-3 min，接着在冰上孵育10 min，之后转至室温下。将ssDNA与未偶联了SEB的预活化填料充分结合30 min，去除非特异结合的ssDNA分子。然后将上清液和偶联了SEB的预活化填料充分结合30 min，然后用500 μL的7 M urea清洗15 min，填料用2000 rpm离心2 min收集上清。aptamers利用PCR进行扩增，后经乙醇沉淀，进行后续亲和力鉴定。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 填料 | 17043001 | CNBr activated Sepharose 4B | 10 g |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/20 |
