作者：Uday Ganapathy et al.
发表日期：2015年8月
发表期刊：Nature Communications
研究背景
结合分岐杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, Mtb) 是一种有适应能力的能够感染细胞内的细菌，能够引起结核病，可以在巨噬细胞中休眠，Mtb的碳代谢显示Mtb优先选择Fatty acid脂肪酸作为碳来源而非糖酵解的底物，而糖异生过程 (生物体将多种非糖物质转变成葡萄糖或糖原的过程) 是脂肪酸转化为生物能的关键步骤，糖异生过程的限速步骤为FBPase酶 (果糖-1,6-二磷酸酯酶) 的催化过程，将fructose 1,6-bisphosphate (FBP) 转化为fructose 6-phosphate (F6P)，该催化过程也是阻断Mtb的碳代谢是潜在的药物靶点。Mtb的基因组中GLPX被认为是Mtb编码的唯一的FBPase酶。但是将敲除了GLPX的Mtb菌株仍然可以在依赖糖异生作用的碳源 (甘油glycerol，丁酸盐butyrate) 上生存，说明GLPX并不是唯一的FBPase，菌体中应当存在其他的FBPase。菌体裂解液上清通过四步层析，最终收集的组分经过SDS-PAGE，将条带的浓度分布对比活性的强弱分布，鉴定出分子量约25 kD的条带，经过LC-MS/MS分析出序列信息，该蛋白为GPM2。将GLPX和鉴定出来的新FBPase即GPM2进行双敲除后的Mtb突变菌株才不能够通过糖异生作用增殖。同时双敲除的Mtb突变菌株感染了动物后，滴度不能提高，也不能够让动物肺部产生病变，而单敲除GLPX和GPM2其中之一的突变株和野生型突变株都能在动物肺部增殖并引起肺部病变损伤。
实验方法
敲除GLPX的Mtb突变菌株经过2 L体系的培养后，收集的菌体用缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7.7，8 mM MgCl2，10% glycerol，10 mM b-mercaptoethanol重悬裂解，上清液先通过HiTrap Q Sepharose FF 1 mL离子交换预装柱分离纯化，样品上样后，用0-6 M NaCl线性梯度洗脱25 CV。收集的活性成分经过1:1的比例用2 M ammonium sulfate稀释后用HiTrap Phenyl Sepharose FF 1mL疏水相互作用预装柱分离纯化，进样后用1-0 M ammonium sulfate线性梯度洗脱 20 CV。收集的活性成分经过浓缩用Superose 6 10/300 GL分子筛预装柱分离纯化，收集的活性成分最后用Mono Q 5/50 GL 高分辨率离子交换预装柱分离纯化，样品上样后，用0.1-0.4 M NaCl 线性梯度洗脱 25 CV，收集活性成分进行鉴定分析。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17505301 | HiTrap Q FF | 5 × 1 mL |
| 预装柱 | 17519301 | HiTrap Phenyl FF (HS) | 5 × 5 mL |
| 预装柱 | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
| 预装柱 | 29275878 | Capto HiRes Q 5/50 | 1 × 1 mL |
| 填料 | 17531610 | Capto Q | 25 mL |
| 填料 | 17545101 | Capto Phenyl (HS) | 25 mL |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/20 |
