作者：Herron et al.
发表日期：2018年12月
发表期刊：BMC Biotechnology

研究背景

全球蛋白质药物市场的复合年增长率是所有药物类别中最高的，但与传统化学药物相比，它们的可获得性(尤其是在美国市场以外)受到生产和验证的高成本的影响。转基因技术的改进使转基因动物能够生产出有价值的蛋白质;在成功的临床试验和监管机构批准后，从这种动物生物反应器中提取的几种治疗性蛋白质已经上市。尽管鸡具有许多潜在的优势，但由于生产转基因鸟类的历史困难，鸡在生物反应器的发展方面落后于哺乳动物，但与传统的基于细胞培养的生产系统相比，用转基因鸡的蛋清生产治疗性蛋白将大大降低整个生产周期的成本。这可能导致更廉价的治疗和更广泛的市场，包括在发展中国家和动物卫生应用。

鸡胚培养的抗体Fc融合的猪CSF1-Fc (Macrophage colony-stimulating factor 1)细胞菌落刺激因子，不仅可以提高半衰期，还可用抗体纯化的亲和方法高效的进行捕获，MabSelect SuRe填料可以和抗体的Fc片段进行特异结合，具有高亲和力和易于清洗再生的优点，再通过分子筛的方法去除聚集体或小分子杂质等，以得到高纯度的猪细胞因子CSF1样品。

实验方法

蛋清样品用pH = 3，50 mM PBS缓冲液以1 : 4稀释处理，调节pH到4，室温搅拌10 min以沉淀卵粘蛋白，在10℃以25000 g 离心45 min，收集上清调节pH到7，再在10℃以25000 g 离心45 min除去沉淀。

第一步，将样品稀释10倍，使用5 mL HiTrap MabSelect SuRe的蛋白A亲和柱进行目标Fc融合的细胞因子的捕获。使用50 mM PB (pH = 7)溶液，以5 mL/min的流速平衡亲和柱。上样完成后，使用50 mM PB (pH = 7)溶液进行10个CV的洗杂，然后用3—5个CV，100 mM CB (pH = 3)溶液进行洗脱。在收集管中使用1 M Tris，pH = 9缓冲液进行样品的中和。MabSelect SuRe亲和柱采用3 CV CB溶液和5 CV PB溶液进行再生，并用5 CV 0.5 M NaOH溶液进行CIP清洗，最后用10 CV 20%乙醇溶液进行保存。

第二步，使用Superdex 200 26/600分子筛去除杂质，如聚集体等。以2.5 mL/min的流速使用PBS溶液进行平衡和洗脱。对分离峰进行收集之后，使用1-2CV 20%乙醇溶液进行保存。分离组分以SDS-PAGE方法进行蛋白纯度的检测，WB方法检测Fc融合片段的存在，MTT assay进行细胞因子活性的检测。

纯化后细胞因子纯度经RPLC测得>=97%，回收率达80%—90%，浓度为100 mg/100 mL ，经SEC测得分子量为95.1 kDa，无明显聚集体存在，其中有9.5 kDa糖基化约占10%，经MS检测无鸡胚蛋白污染残留。

产品信息

Reference
Lissa R. Herron. et al. A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines. BMC Biotechnology (2018) 18:82.