作者：Haiqiao Bian et al.
发表日期：2021年10月
发表期刊：Pathogens
研究背景
猪圆环病毒2型(PCV2)是圆环病毒科圆环病毒属的一员。1991年从北美断奶后多系统耗损综合征猪身上分离出该病毒。其他疾病也与PCV2感染相关，包括猪繁殖失败、猪呼吸系统疾病和肉芽肿性肠炎。这些疾病给全球养猪业造成了巨大的经济损失。美国猪兽医协会将与PCV2感染相关的疾病定义为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。
在欧洲，猪圆环病毒病(porcine circovirus disease, PCVD)常被用来指PCVAD，PCV2基因组呈环状、单链、共价封闭，由典型的两亲性DNA组成。基因组长度仅为1766-1768 nt，包含5个开放阅读框(orf)：ORF1、ORF2、ORF3、ORF4和ORF5。其中ORF1和ORF2的研究比较深入。前者编码病毒复制酶相关蛋白(Rep和Rep’），后者编码病毒衣壳蛋白(Cap)。ORF1和ORF2赋予PCV2病毒两个基本特征:病毒基因组可以复制并成功组装成成熟的子代病毒。
病毒纯化技术应用于许多领域，如病毒结构分析、病毒入侵宿主细胞分析、病毒特异性受体鉴定、特异性抗体产生等。随着疫苗质量的提高，病毒纯化技术在疫苗生产中的应用越来越广泛。
PCV2是一种20面体对称的小型无包膜病毒(T = 1)，每个病毒颗粒由60个CAP蛋白组成，病毒直径约为17 nm。氯化铯(Cesium chloride, CsCl)梯度密度离心纯化PCV2是常用的方法。此外，还有一些病毒纯化的色谱方法。例如从蛹中纯化PCV2 VLPs的三步流程，包括洗涤剂提取、硫酸铵沉淀和阴离子交换柱层析。采用体积排除层析法纯化了表达于大肠杆菌中的PCV2重组CAP蛋白。此外，利用Q Sepharose XL和阳离子交换建立了从酵母裂解液中分离PCV2 CAP VLPs的两步色谱纯化方法。然而，目前还没有亲和色谱法纯化PCV2的报道。在本研究中，我们报道了一种基于PCV2广谱单克隆抗体(mAb)的亲和层析法，以获得高纯度的PCV2。
实验方法
捕获抗体
- 利用protein G亲和层析柱捕获纯化广谱单抗mAb 3A5，从4 mL小鼠腹水中，使用G Sepharose CL-4B柱纯化出26.5 mg mAb 3A5 IgG，纯度为94.6%。
偶联抗体
- 将20 mg纯化的IgG用耦合缓冲液(0.1 M NaHCO3溶液，含0.5 M NaCl, pH 8.3)在4 ℃透析18 小时，然后与预活化填料CNBr-activated Sepharose 4B混合、孵育、偶联。
偶联检测
- 20 μL IgG偶联CNBr-activated Sepharose 4B用SDS-PAGE进行分析。结果显示，偶联的IgG-CNBr Sepharose 4B包含单抗3A5的轻链和重链。
纯化病毒
- 1 mL的偶联基质加入澄清的病毒溶液中，在4℃旋转过夜。去除未与mAb 3A5结合的蛋白，将柱垂直固定，用20CV的缓冲液(20 mM NaHPO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4)洗涤。使用洗脱缓冲液(0.1 M甘氨酸-HCl, pH 3.0)将PCV2a/LG从柱上洗脱，每1 mL洗脱液混合100 L 1 M Tris-HCl (pH 8.0)。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 填料 | 17061802 | Protein G Sepharose 4 FF | 25 mL |
| 填料 | 17043001 | CNBr activated Sepharose 4B | 15 g |
