作者：Elmer et al.
发表日期： 2011年1月
发表期刊：J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.

研究背景

目前在开发可用作献血替代品的基于血红蛋白的氧气载体（HBOCs）方面取得了实质性进展。然而，这些HBOC的大规模生产需要足够的高纯度血红蛋白（Hb）。Hb可以通过裂解红细胞（RBC）轻松获得。然而，红细胞还含有数百种可溶性蛋白质杂质，在合成HBOC之前必须从储备Hb溶液中去除这些杂质。有几种方法可以从红细胞中纯化Hb，包括热处理、水相萃取和阴离子交换色谱法。
切向流过滤（TFF）也已被用于有效纯化红细胞中的Hb。在TFF工艺中，Hb通过50 nm和500 kDa TFF膜（去除病毒和细胞碎片）过滤，并用50-100 kDa TFF膜浓缩，该膜还可以去除一些小杂质。尽管TFF具有吸引人的特性（低成本，操作简单快捷），最近的结果表明，最终的TFF Hb产品中存在微量杂质（如过氧化氢酶）。因此，本文作者决定在TFF工艺中添加一个亲和分离步骤，以去除这些不需要的杂质。
本文作者采用了两种不同的工艺路线，并通过各种检测手段确认最终纯化方案。

实验方法

首先进行血细胞的沉淀与裂解。血液以3716g离心30分钟（4°C）以沉淀红细胞；弃去血浆上清液，然后将红细胞重悬于等渗0.9%盐水溶液中并在4°C下以3716g离心30分钟； 洗涤红细胞沉淀3次；将红细胞沉淀重悬于3.75mM磷酸盐缓冲液（PB，pH = 7.2）中，并在4°C下裂解过夜。
接着使用一步或者三步切向流过滤，50nm&500 kDa MWCO切向流过滤，去除病毒、大颗粒和细胞碎片， 同时Hb在滤液中透过；25 kDa or 50 kDa MWCO，Hb被保留和浓缩。IMAC纯化取自第1阶段（S1F）结束时的滤液——方案一和在第 3 阶段 （S3R） 结束时截留——方案三。样品分装后储存在-80°C。
接下来用XK 50/30层析柱，装填Chelating Sepharose Fast Flow（IMAC）填料，使用如下buffer进行纯化Buffer 1为20 mM Tris，500 mM NaCl，pH = 8.3； Buffer 2为200-500 mM Tris+ 500 mM NaCl，pH = 8.3；Buffer3为20 mM Tris，pH = 8.3
终样品经过10 kDa离心过滤器浓缩，储存在-80°C。

产品信息

Reference
Elmer et al. Purification of hemoglobin from red blood cells using tangential flow filtration and immobilized metal ion affinity chromatography.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2011 January 15; 879(2): 131–138