作者：Serene W. Chen et al.
发表日期：25 JAN 2020
发表期刊：Mabs

研究背景

串联单链可变片段（scFv）双特异性抗体（bsAb）是迄今为止报道的最有前景的 bsAb 之一。由于串联scFv的bsAb缺少Fc区域，因此，不能用纯化单抗的成熟方案。同时，因为缺失Fc区域，使得抗体更易于聚集，进而产生更多的杂质，给下游纯化带来一定的挑战。为此，通过有效的方法来分离纯化这类抗体至关重要。本研究向Protein L亲和层析的洗脱缓冲液中分别添加氯化钠（NaCl），氯化钙（CaCl2）和 L-精氨酸单盐酸盐（Arg·HCl），探究当盐离子存在下聚集体与单体分离情况和机理。本研究还开发了两步纯化工艺，通过使用 Protein L 亲和层析捕获和Capto adhere多模式层析精纯以获得最佳回收率和纯度。

实验方法

样品收获：靶向CD19 和 CD3 的串联scFv bsAb在CHO K1 细胞成功表达后，离心取上清。

捕获阶段：用 含50 mM HEPES，120 mM NaCl，pH 7.4缓冲液平衡Protein L 层析柱，将细胞上清以10 mg 单体/mL 填料的量进行上样。经ÄKTA avant内置DoE软件优化，用含有513 mM Arg·HCl，87 mM NaCl，pH 6.7缓冲液冲洗5 个CV，以获得最佳的HCP 去除效果和目的物的收率。再用含有50 mM HEPES ，pH 7.4缓冲液冲洗 5 个 CV ，以降低电导值。接着用含有100 mM Arg·HCl，pH 3.0 醋酸盐洗脱缓冲液进行洗脱。

精纯阶段：使用50 mM MES、pH 6.0 缓冲液平衡Capto adhere层析柱，将上一步纯化得到的洗脱液调节至 pH 6.0，稀释 3 倍至电导率 6-7 mS/cm，然后上柱。在50 mM MES、300 mM、350 mM、400 mM NaCl，pH 6.0 缓冲液中依次洗脱，得到目的产物scFv bsAb。

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Reference
Investigation of the effect of salt additives in Protein L affinity chromatography for the purification of tandem single-chain variable fragment bispecific antibodies