作者：Kathrin Kowarschik et al.
发表日期：2017年10月
发表期刊：New Phytologist
研究背景
泛素化是由酶级联介导的，导致底物蛋白质的修饰，重新定义它们的命运。这种翻译后修饰参与大多数细胞过程，但由于其复杂性和普遍性，其分析面临多种障碍。细菌系统中泛素化级联的重建绕过了这些问题中的几个，并被证明忠实地再现了这一过程。在这里，文章展示了UbiGate——一个合成生物学工具箱，以及一个可诱导的细菌表达系统——通过“金门”克隆，使大肠杆菌中不同生物体的泛素化级联直接重建。这个包含工具箱使用分层模块化克隆系统组装复杂的DNA分子编码泛素化级联的多个遗传元素在预定义的顺序，以产生多顺反子操纵子的表达。文章证明了UbiGate在通过不同E3连接酶及其底物修饰生成多种表达元件来重建自泛素化方面的效率，以及它在时间和成本效益方面的解剖过程的有效性。
泛素(Ub)附着在底物蛋白上，被称为泛素化，参与几乎所有的细胞过程，包括蛋白酶体降解、DNA修复和内吞降解途径，以及选择性自噬。数千种底物的特异性修饰依赖于Ub激活酶 (E1s)、Ub 结合酶 (E2) 和Ub连接酶 (E3)：据预测，拟南芥基因组编码两个E1，37个E2和超过1400个E3蛋白。E1利用ATP在其活性位点的半胱氨酸和Ub的羧基端之间生成硫酯键。活化的Ub随后被转移到E2活性位点内的Cys残基上，而Ub-E2随后与E3配对，介导Ub附着在底物上。E3可以大致分为两大类，RING/U-box和HECT。环域，或与结构相关的U-box，为E2提供了对接面。RING/U-box E3有两个主要功能：它们使底物和带电荷的E2靠近，并激活E2-Ub共轭物，使Ub连接到底物中可接近的赖氨酸。相比之下，HECT型E3与E2-Ub复合物结合，并将Ub部分转移到HECT结构域，在介导底物泛素化之前形成Ub硫酯键中间体。
实验方法
离心法纯化法，细胞裂解液20000g低温离心澄清。
亲和层析纯化法，利用金属螯合层析柱或谷胱甘肽柱进行亲和捕获标签蛋白。
采用以下缓冲液进行纯化：IMAC (50 mM NaH2PO4，pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM咪唑)，变性IMAC (50 mM NaH2PO4,，pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM咪唑，8 M尿素)， GST标记蛋白 (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3)。
最后用SDS-PAGE分离和PVDF膜WB，使用指定抗体对样品进行免疫印迹分析。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17092005 | HiTrap IMAC HP | 5 x 5 mL |
| 预装柱 | 17528202 | GSTrap HP | 5 x 5 mL |
| 填料 | 17092107 | IMAC Sepharose 6 FF | 25 mL |
| 填料 | 17527901 | Glutathione Sepharose HP | 25 mL |
| 空柱 | 28988946 | Column XK 16/70 | 16/70 |
