作者：Yinglu Cui., et al.
发表日期：2024年02月
发表期刊：Nature Communications

研究背景

在过去的二十年里，大量的努力致力于发现和设计PET解聚酶，促进了PET生物降解的发展，从检测痕量释放产物到实现高转化率。在应对酶法PET回收带来的挑战时，应考虑关键参数，以获得经济上可行的工业过程，特别是高固体量(>150 g kg−1)和高产品收率(>90%) 。然而，几乎所有的研究都在底物固体量低于30 g kg - 1时获得了可观的解聚产率，这大大低于工业相关水平。当底物固体量增加到较高水平时，通常会观察到解聚速率和转化率的降低(称为“固体效应”)，如在其他非均相反应中所证明的那样，如生物质转化过程。

本研究作者通过采用人工智能辅助设计策略来设计细菌HR29的解聚酶来解决当前的挑战。经过重新设计的变体TuroPETase优于其他已知的PET水解酶。在200 g kg – 1高固体量下，可在8小时内完成几乎完全解聚。动力学和结构分析表明，性能的提高可能归因于更灵活的PET结合凹槽，有助于靶向更精确的结合位点。总的来说，研究结果构成了对工业上适用的聚酯水解酶的理解和工程的重大进展，并为进一步研究其他类型的聚合物提供了指导。

实验方法

将含有BhrPETase、LCC、LCCICCG、PES-H1L92F/Q94Y、FastPETase及其变体基因的质粒转化到大肠杆菌BW25113中。将ICCGI6M、depopetase9和capetasem9质粒转化为大肠杆菌C41(DE3)，将HotPETase质粒转化为大肠杆菌Rosetta gami-B细胞。将细胞在2×YT培养基中37℃培养至OD600 nm ~0.8，然后加入0.2% (w/v) L-arabinose或1mM异丙基β- d -硫代半乳糖苷诱导表达。

细胞在20℃下培养20 h，离心(10,000 × g, 10 min, 4℃)收获，悬浮在裂解缓冲液 (50mM Na₂HPO₄, 100mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.5)中。在冰上用超声波对细胞进行破坏。4°C, 14000 × g离心60min，得到细胞提取物，用0.22 μm 滤膜过滤，去除沉淀。

未结合蛋白在5mL HisTrap HP柱中洗涤，洗涤缓冲液(50mM Na₂HPO₄, 100mM NaCl, 60mM咪唑，pH 7.5)，洗脱缓冲液(50mM Na₂HPO₄, 100mM NaCl, 300mM咪唑，pH 7.5)洗脱目标蛋白。然后，用HiPrep 26/10脱盐柱将缓冲液交换为存储缓冲液(50mM Na₂HPO₄和100mMNaCl, pH 7.5)。

纯化后的酶保存在4℃。以牛血清白蛋白为参比物，用BCA法测定蛋白质浓度。

产品信息

Reference
https://www.nature.com/articles/s41467-024-45662-9