作者：Hao Song et al
发表日期：2019年月6日13日
发表期刊：Cell
研究背景
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是一类可引起发热、皮疹、关节疼痛的蚊虫传播病毒。该病毒病主要分布在热带和亚热带地区。人感染该病毒后可致急慢性的外周关节痛或关节炎，严重时致人死亡。基孔肯雅病毒自1952年首次被分离以来，至今已有60多年，直到近来，科学界才证实MXRA8 (Matrix remodeling-associated protein 8)分子是基孔肯雅病毒的受体，但是MXRA8分子如何介导基孔肯雅病毒的入侵却是个未解之谜。
2019年5月9日，中国科学院北京生科院、微生物所高福院士团队与中国科学院天津工业生物技术研究所高峰研究团队在期刊Cell上发表了题为“ Molecular Basis of Arthritogenic Alphavirus Receptor MXRA8 Binding to Chikungunya Virus Envelope Protein ” 的研究成果，该研究首次从分子水平阐明了基孔肯雅病毒囊膜表面E (CHIKV E)蛋白与其受体MXRA8分子的相互作用，揭示了此类病毒入侵细胞的分子机制，为抗病毒药物开发及新型疫苗设计提供了新靶点。
实验方法
mMXRA8制备：将编码 mMXRA8 的 Ig 样结构域(残基 S22T291)和人 MXRA8-2 同种型(hMXRA8，残基G25-A292)的 DNA 分别克隆到具有NdeI和XhoI限制性位点的pET21a载体中，并转化到大肠杆菌菌株BL21 (DE3)用于蛋白质表达。以相同方式构建预测的hMXRA8-pD1(残基 G25-G159)和hMXRA8-pD2(残基 P160-A292)质粒。将包涵体在搅拌复性缓冲液(100 mM Tris HCl、2 mM EDTA、400 mM L-精氨酸、0.5 mM 氧化型谷胱甘肽和 5 mM 还原型谷胱甘肽，pH 8.0)中在4°C下逐滴稀释8小时。将复性后的蛋白质浓缩并将缓冲液置换为含有20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8.0的溶液。随后，通过在HiLoad 16/600 Superdex 75 pg色谱柱进一步纯化。
将合格的峰分离蛋白质浓缩用于进一步研究或结晶。突变的hMXRA8质粒是通过定点诱变构建的，其中涉及CHIKV E3-E2-E1结合的鉴定残基被单独突变。
用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统产生重组p62-E蛋白。CHIKV p62-E1、ONNV p62-E1 (GenBank: AF079456) 的编码序列在多启动子的控制下分别克隆到修饰的 pFastbac DualPlasmid中。将绿色荧光蛋白 (GFP) 置于 P10 启动子的控制下以可视化其表达。
对于每个构建体，使用单独的真实p62信号序列，并且将Twin-Strep-tag II放置在hexa-His标记的前面，然后将其添加到C末端以促进进一步的纯化过程。使用HisTrap HP 5 mL柱亲和层析的方式从细胞上清液中回收可溶性E蛋白，然后使用StrepTrap HP 5 mL柱通过另一轮亲和层析纯化。对于结晶，使用带有20 mM Tris-HCl和150 mM NaCl (pH 8.0) 的运行缓冲液的HiLoad 16/600 Superdex 200 pg进一步纯化蛋白质。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28989333 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | 1 × 120 mL |
| 填料 | 17104401 | Superdex 75 pg | 150 mL |
| 预装柱 | 17524801 | HisTrap HP | 1 × 5 mL |
| 填料 | 17526801 | Ni Sepharose HP | 25 mL |
| 预装柱 | 28907547 | StrepTrap HP | 1 × 5 mL |
| 填料 | 28935599 | StrepTactin Sepharose HP | 10 mL |
| 预装柱 | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | 1 × 120 mL |
| 填料 | 17104301 | Superdex 200 pg | 150 mL |
