作者：Yingzi Cui et al
发表日期：2020年月8日4日
发表期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences
研究背景
萨奇病毒 A10 (CV-A10) 是 A 型肠道病毒 (EV-A) 亚群的成员。 CV-A10感染经常会引起手足口病(HFMD)，除以发热和水疱性皮疹为特征的急性发热性疾病除手足口病外，CV-A10 感染还可引起如疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎 。含 Kringle 的跨膜蛋白1 (KRM1) 最近被鉴定为CV-A10的必需进入受体，KRM1是一种广泛存在的膜锚定蛋白，位于细胞表面和细胞内膜。 KRM1的胞外域由三个类似大小的结构域组成：N端Kringle (KR)域、中间折叠不良的WSC域和C端的伪Ig样CUB域。然而，KRM1介导这些病毒进入的确切分子机制仍未完全了解。
在这项工作中研究者提供了生化证据，表明成熟的CV-A10病毒粒子可以在中性和酸性环境中与KRM1结合。结构研究将KRM1鉴定为CV-A10进入的二合一受体，并表明低pH条件和受体结合对启动CV-A10脱壳具有重要作用。这些发现提供了对肠道病毒感染过程的深入了解，并确定了抗病毒干预的新目标。
实验方法
人 RD 细胞培养在Dulbecco改良的Eagle培养基中，该培养基补充有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素。CV-A10感染RD细胞。受感染的细胞在37°C下孵育36小时，以12000 × g离心60分钟以去除细胞碎片。病毒用30% (wt/vol)的蔗糖垫沉淀，并重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在15%到45% (wt/vol) 蔗糖密度梯度上观察到两条带，通过使用NanoDrop分光光度计测量260和280 nm处的光密度(OD)来量化每个部分，并通过负染EM和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步检测。
人KRM1胞外域(A23-G373)被合成并克隆到pCMV3 (Sino Biological)中，分别使用HindIII和BamHI位点在N端具有人IL-2信号序列，在C端具有10个组氨酸。将重组质粒瞬时转染到HEK293T细胞中进行KRM1表达。在转染后7天收集上清液并离心以去除细胞碎片，随后通过Ni-NTA色谱法纯化蛋白。使用溶解在PBS中的300 mM咪唑洗脱目标蛋白。然后将级分透析到PBS中，然后使用Superdex 200 Increase 10/300 GL柱进行凝胶过滤。
人KRM1突变质粒通过定点诱变构建，其中鉴定出的参与CV-A10结合的关键残基(D90A、W106A和Y165A)分别突变，蛋白质通过相同的方法纯化。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 29051021 | HisTrap HP | 1 × 1 mL |
| 填料 | 17526801 | Ni Sepharose HP | 25 mL |
| 预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
