作者：Mietzsch M et al.
发表日期：2021年9月
发表期刊：Journal of Virology
研究背景
腺相关病毒（AAV）由于不会引起任何人类疾病，而获得广泛关注及研究，已成为最有前途的基因治疗载体之一，可用于多种单基因疾病的体内基因治疗。野生型AAV基因组大小约为4.7 kb，基因组两端含有相同的150个核苷酸反向末端重复序列（ITRs），行程t形发卡二级结构，在两个ITRs之间，有两个开放阅读窗（ORF），Rep和Cap，以及两个较小的辅助蛋白，组装激活蛋白（AAP）和膜相关辅助蛋白（MAAP）。四种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）在病毒复制周期和载体生产中起着关键作用，其中Rep78/68对基因组复制是必不可少的，Rep52/40则负责将基因组包装到由第二个ORF编码的Cap蛋白（VP1、VP2、VP3）形成的病毒衣壳中。
野生型或重组AAV基因组通过Rep52/40蛋白预先形成空VP衣壳，Rep78/68蛋白复制基因组后，产生的ssDNA基因组被认为通过Rep52/40蛋白的解旋酶结构域易位到病毒衣壳中。由于基因组包装被认为是限速步骤，因为会发生大量衣壳保持空的状态，由于AAV介导的基因治疗，空病毒衣壳不仅不提供任何治疗益处，甚至可能诱导不必要的免疫反应，因此，去除空衣壳在整个AAV生产过程中必不可少。
AAV通过不同的衣壳，使得其对不同的组织具有亲和性，而AAV的13种血清型中，Rep蛋白和Cap蛋白氨基酸序列同源性在52%-99%之间，故在生产不同血清型重组AAV是通过目的血清型的Cap基因加上AAV2的Rep基因进行转染获得。作者发现将AAV2 Rep基因组替换成与Cap基因组一致的血清型时，可提高载体的包装效率，但衣壳表达总体较低，作者将Rep基因的39末端还原到AAV2 Rep基因中，发现嵌合体的Rep基因，在保证了高的包装效率后，还能得到高衣壳表达率。作者在文章中对多种血清型的AAV进行实验测试，在如AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh.10均得到较好结果，为改善AAV生产提供了研究基础。
实验方法
构建pTR-UF-Luciferase、pHelper和含有野生型或杂交型（嵌合体）Rep基因的Rep-Cap质粒，对HEK293细胞进行三次转染，制备外壳带有荧光素酶基因标记的重组AAV病毒载体。转染后72h，收获HEK293细胞，2000 g下离心5 min，在1×TD缓冲液（1×PBS缓冲液中添加1 mM MgCl2和2.5 mM KCl）中重悬，进行3次冻融循环，得到细胞裂解物。粗裂解物在37℃下用核酸酶处理，用于降解未包装的DNA，处理1 h后离心30 min，通过添加10%聚乙二醇8000（w/v）回收释放到培养基中的AAV载体，随后9000 g下离心90 min。
将AAV与等体积1× TD缓冲液混合稀释，不同血清型AAV（AAV1、2、6、rh.10）加载到HiTrap AVB Sepharose High Performance 1 mL预装柱中，使用1×TD缓冲液在0.5 mL/min流速下平衡10 CV，继续使用1×TD缓冲液冲洗20 CV，使用pH 2.6的0.1 M glycine-HCl洗脱，洗脱下来的组分立即使用1/10（v/v）pH 10的1 M Tris-HCl进行中和。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28411211 | HiTrap AVB Sepharoose HP | 5×1 mL |
