作者：A.S. Moreira et al
发表日期：2021年11月1日
发表期刊：Separation and Purification Technology
研究背景
基于人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的慢病毒载体 (LV) 由于其宝贵的特性，越来越多地作为基因和细胞治疗的工具。这种 80-120 nm 的载体具有整合大量有效载荷（高达 9 kb）、转导分裂和非分裂细胞的能力。 LV 是稳定和持续长期基因表达的首选载体，目前主要用于将治疗基因递送至原代细胞，以治疗传染病或遗传疾病。
为了满足不断扩大的制造需求，基于悬浮细胞培养和改进的包装细胞系的生产工艺逐渐被开发和优化，并且灌流模式的生物反应器也已上市。此外，改进的下游工艺可确保提高最终效价和适当的杂质清除率。符合 GMP 的下游纯化过程通常从核酸消化和澄清步骤开始，以减少 DNA 含量和大小并去除细胞和细胞碎片；通常，最后的 DSP 操作是无菌过滤。中间纯化和浓缩步骤包括阴离子交换色谱 (AEX) 和切向流过滤 (TFF)，由于 LV 对剪切力和高电导率的敏感性，这些步骤至关重要。因此DSP 的改进必须集中在这些操作单元上，尤其是 AEX，因为这一步呈现出最低的回收率。使用实验设计 (DoE) 方法可以对 AEX 步骤进行全面研究，并已证明在通过识别和优化关键工艺参数 (CPP) 并最终构建预测模型来优化生物制药纯化过程中非常有用。
实验方法
HEK293T 细胞 (ATCC® CRL-3216™) 在补充有 10% (v/v) 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)且含有4 mM GlutaMAX™和 1 mM 丙酮酸钠， 5% CO2 的培养箱中保持37°C。通过台盼蓝排除法评估细胞浓度和活力。使用线性 25 kDa 聚乙烯亚胺在组织烧瓶中以 1:1 (DNA:PEI) 的质量比转染 1.5x105 个细胞/cm2。转染后 24 小时更换培养基，并在培养基更换后 24 和 48 小时（分别在转染后 48 和 72 小时 (hpt)）收获 LV。收获后立即使用 50 U/mL Benzonase®和 2 mM 氯化镁进行 DNA 消化。消化在室温下进行 30 分钟。
使用不同的膜材料：聚醚砜 (PES)、聚偏二氟乙烯 (PVDF)、尼龙和玻璃纤维 (GF)。此外，还评估了 0.45 μm 聚丙烯 (PP) 深层过滤器和单层 0.65–0.2 μm PES 过滤器。评估了 GF 预过滤器对 PVDF、尼龙和 PES 过滤器性能的影响。具有三个中点的全因子实验设计 (DoE)进行了评估病毒载量的影响（从 50 到 200膜体积）、缓冲液 pH 值（从 7 到 8）和 NaCl 浓度LV 转导和总物理颗粒回收率的洗脱（从 0.7 到 1.3 M）。
色谱法纯化病毒在由 Unicorn控制的 Akta avant 150 设备，室温下进行。使用 Capto DEAE、Mustang Q 膜、Sartobind Q 膜和 Natriflo® HD-Q 膜对色谱介质进行初步筛选。根据说明将大约 40 mL Capto DEAE 填充到 XK 26 柱中，不对称因子在 1.0 和 1.1 之间。装置用 10 mM 组氨酸、0.15 M NaCl、17% 蔗糖、pH 7 缓冲液平衡；在澄清、Benzonase 处理、装载和洗涤后，结合的 LV 用 0.7 M NaCl 步骤洗脱。评估了 LV 转导颗粒回收率和体积浓度因子，以比较不同色谱介质的性能。进行了更深入的研究，以比较使用 Mustang Q 和 Sar tobind Q 膜在从 96 孔板 (DoE) 到 0.86 或 1-mL 膜体积 (MV) 装置的不同规模的 LV 纯化性能。小型设备以 10 MV/min 的流速运行；上样后，未结合的材料用 60 MV 平衡缓冲液洗涤，并用三个 NaCl 浓度（0.4、1.0 和 1.5 M）步骤进行洗脱。蔗糖浓度对 Mustang Q 和 Sartobind Q 膜的影响通过在色谱缓冲液中进行不含蔗糖和 3% (m/v) 和 17% (m/v) 蔗糖的实验来评估。 Mustang Q 膜的动态结合能力是使用 0.86 mL 装置使用 10 MV/min 的流速测定的，并通过高达 1600 MV 的负载评估膜流中的总颗粒浓度。对于 Mustang Q 5 mL 胶囊，使用两种 NaCl 浓度（0.4 和 1.5 M）进行洗脱。在所有色谱实验中，从色谱膜洗脱后，立即用平衡缓冲液将 LV 组分稀释 2 至 3 倍，以最大限度地减少病毒暴露在高盐浓度。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 29400457 | HiTrap Capto DEAE | 1 × 1 mL |
| 填料 | 17544310 | Capto DEAE | 25 mL |
