作者：Mattias Leino et al.
发表日期：2023年4月
发表期刊：New BIOTECHNOLOGY

研究背景

细胞状态由复杂的信号转导通量来协调，这些信号转导通路通过蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰来传递。为了研究各自生理和病理机制，需要许多分子生物学方法来监测这些细胞状态。在许多已开发的分子生物学工具中，杂交链式反应（HCR）是一种可以触发DNA纳米结构自组装的系统，HCR已被用于多种应用，包括原位杂交（ISH）、免疫信号杂交链式反应（isHCR）等。

典型的HCR反应由一对发夹结构寡核苷酸和触发寡核苷酸组成。链式反应的驱动力在于储存在发夹结构环区域中的势能。而聚合是通过添加触发寡核苷酸来启动的，触发寡核苷酸可以结合其中一个发夹结构的立足点随后形成聚合，并可以自由地作为另一个发夹的新的触发寡核苷酸，从而进一步促进聚合。此过程将一直持续直到形成长的有缺口的双链DNA分子。

用于HCR的发夹结构通常很小，可以通过寡核苷酸来进行生产，这种方法既价格便宜又容易获得。寡核苷酸通常是通过合成周期一次逐步偶联一个核苷酸来合成的。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）、反相色谱和离子交换色谱等后续纯化步骤可以去除寡核苷酸合成过程中的产生一些错误产物，但是较小的误差可能比较难以解决。发夹中的二级结构会使其更难纯化，问题也随之增加。因此本文研究了不同的纯化策略，以提高HCR发夹的再现性和质量。

实验方法

寡核苷酸发夹结构是在 NUPACK设计工具的帮助下进行设计的。随后使用PAGE纯化对整个发夹进行纯化。将寡核苷酸样品在10% TBE胶上55℃进行跑胶，100V跑75min。染色后切胶，切下相应含发夹结构的条带并进行胶回收。

制备的发夹结构共分为两类，一个短的6mer寡核苷酸和一个长的34mer寡核苷酸。两者经处理后混合，加入ATP、DTT、PNK和T4连接酶等试剂进行连接。

为了从连接的寡核苷酸中去除未连接的34mer寡核苷酸，首先使用磁珠进行第一步纯化。取750μl链霉亲和素磁珠在水中洗涤一次，再在提取缓冲液（8mM Tris，0.8mM EDTA，1M NaCl，pH 8）中洗涤三次。随后向该混合物中加入300μl连接的寡核苷酸产物，并在4℃条件下孵育过夜。当发夹结构的寡核苷酸与磁珠结合后，用PBS在60℃下洗涤磁珠8次，每次洗涤过后孵育5分钟。最后一次洗涤后，使用过量的生物素洗脱寡核苷酸并再4℃下过夜孵育。这时其中一部分经磁珠纯化后得到的寡核苷酸纯度还不够高，因此接下来在使用AKTA Pure 层析设备和Superdex 200 10/300 GL分子筛柱子来进行进一步层析纯化。两步纯化后，通过纳米液滴分光光度计测定得到寡核苷酸的浓度。

将以上方法制备的寡核苷酸发夹结构用作HCR反应。HCR在几种原位染色方法中用于信号放大，为了分析不同纯化策略在原位方法中的效果，在后续实验中作者使用了 isHCR等一系列实验来评估HCR的效果。

产品信息

Reference
Purification of DNA oligonucleotides to improve hybridization chain reaction performance