作者:Xu-Mei Chen et al.
发表日期:2022年10月
发表期刊:International Journal of Molecular Sciences
研究背景
九香虫(Aspongopus chinensis Dallas)是一种可食用昆虫,同时也是一味传统的中药材。本草纲目中就记载了其药用功效,现代医学也认为九香虫对胃癌、食道癌有一定医效。虽然其抗肿瘤作用早已被观察到,但其血淋巴中的抗肿瘤活性成分尚不清楚。本研究采用超滤、凝胶过滤层析、离子交换层析和反相高效液相层析相结合的方法,从九香虫血淋巴中分离纯化多肽组分,并以人胃癌 SCG-7901细胞为研究对象,探究了不同分离组分对胃癌SCG-7901细胞增值的抑制作用。最终分离出一种对SCG-7901细胞增值有显著抑制作用的活性多肽。
实验方法
九香虫去除头部、胸部和翅膀后,将它们的身体放入10 ml 注射器中,然后挤压以释放血淋巴。将血淋巴转移至离心管中,在4 ℃下以12,000 g 离心30分钟后,轻轻刮去顶部液体层(含油)。将水溶液层在4℃下以12,000 g 再次离心30分钟,收集上清液用于进一步研究。
用PBS缓冲液1:4的比例稀释九香虫血淋巴,然后离心1小时(12,000 g,4 ℃),收集上清液。将上清液转移至 MWCO 50 kD和MWCO 3 kD 超滤管中离心1–2小时(4500 g,4 ℃)。血淋巴中的成分分为三个部分:>50 KD 、3–50 KD 和 <3 KD。冷冻干燥后,将这些组分重新溶解在1ml PBS中。研究三种组分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用,表明组分Ⅱ(3–50 KD)的抑制率最高。
选用Sephadex G-50 凝胶填料对组分Ⅱ进行凝胶过滤层析。平衡/洗脱缓冲液为:50 mM Tris-HCl (pH 9.0),紫外检测波长为215。最终组分Ⅱ在凝胶过滤层析中被分出5个峰(Ⅱ- 1_5),随着洗脱被分别收集。将每个级分脱盐,冷冻干燥,并重新溶解在PBS中。研究凝胶过滤层析分离的5个级分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用,表明级分Ⅱ-3的抑制率最高。
接着,级分Ⅱ-3用 resource Q (6 mL) 强阴离子交换柱进行进一步分离,平 衡 缓 冲 液:50mmol/L Tris-HCl ( pH9.0 ) ; 洗 脱 缓 冲 液:50mmol/L Tris-HCl+1mol/L NaCl(pH9.0);以1.5 mL/min流速,50 min-100% B的梯度进行线性梯度洗脱,215nm波长检测,最终分出4个峰(Ⅱ-3_1-4)。研究离子交换层析4个级分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用,表明级分Ⅱ-3-3的抑制率最高。
最后级分Ⅱ-3-3用RP-HPLC 进一步进行纯化,层析柱: X Bridge C18;平衡缓冲液: 99.9%超纯水+0.1%三氟乙酸(TFA);洗脱缓冲液: 99.9%乙腈+0.1%三氟乙酸(TFA);最终分得6个峰(Ⅱ-3-3_1-6)。研究RP-HPLC层析6个级分对SGC-7901细胞的增值及细胞毒性作用,表明级分Ⅱ-3-3-5的具有最高的抑制活性。
后续经过质谱鉴定,Ⅱ-3-3-5是一个分子量为2853.3 Da的活性肽,氨基酸序列也同时被测定。
产品信息
类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
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填料 | 17004301 | Sephadex G-50 Medium | 100 g |
预装柱 | 17117901 | RESOURCE Q | 6 mL |