作者：Damiano Migani et al.
发表日期：2017年03月
发表期刊：Wiley Online Library, on behalf of American Institute of Chemical Engineers
研究背景
葡萄糖苷酶是生物体内糖代谢途径中的重要成员之一，葡萄糖苷酶能水解寡糖底物生成葡萄糖被人体代谢利用，α-葡萄糖苷酶更是直接参与淀粉及糖原的代谢途径。重组人酸性α-葡萄糖苷酶GAA，用于治疗庞贝病的关键酶，病因是细胞溶酶体中GAA的遗传性缺失，使糖原及麦芽糖不能转化为葡萄糖而被利用，以致体内大量糖原在骨骼肌、心肌和平滑肌等组织细胞内聚积而致病。
生产GAA的工艺过程十分挑战，因为GAA常被来自宿主的蛋白酶降解。因此研究GAA在宿主中的表型和HCPs的残留问题非常关键，通过质谱和酶谱分析寻找任何有关蛋白降解的HCPs。
根据法规相关规定，生物药制品对于宿主HCPs有着明确的检测上限规定，例如纯化的单抗mAb样品，<100 ppm HCP，<10 ng/dose DNA，<5% product aggregates等。一些HCPs会与目标分子共同被纯化出来，特别是有一些具有蛋白酶活性的杂质会对样品造成降解。
实验方法
在CHO细胞中重组构建和表达人的酸性α-葡萄糖苷酶，37℃摇瓶培养8 days后收获培养上清。
2000 g离心10 min收集上清，0.22 μm过滤，10 kDa cutoff截留分子量超滤，浓缩4倍。West blot检测GAA表达的存在。
使用1 mL HiTrap Capto Q阴离子交换层析对1：4稀释的GAA样品进行捕获。缓冲液为50 mM sodium acetate pH 6.0 (Buffer A)，1 M sodium chloride in 50 mM sodium acetate pH 6.0 (Buffer B)，流速为1 mL/min。
洗脱策略为：14 CV wash (100% buffer A)，40 CV linear gradient elution (0 - 35% buffer B)，5 CV strip (100% Buffer B)，regeneration (10 CV 0.5 M NaOH, 5 CV Buffer A, 10 CV 20% EtOH)。
通过ELISA对宿主HCPs残留进行检测，相比其他文献的纯化方法：阴离子交换层析Mono Q和亲和层析Con A Sepharose 4B法，此法也具有很好的纯度和回收率。最后利用高分辨率LC-MS/MS和酶谱进行蛋白水解活性HCPs组分的分析。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 29275881 | Capto HiRes Q 10/100 | 1 x 8 mL |
| 预装柱 | 11001303 | HiTrap Capto Q | 5 x 5 mL |
| 预装柱 | 28952096 | HiTrap Con A 4B | 5 x 5 mL |
