作者：Josephs TM et al.
发表日期：2021年4月
发表期刊：Science
研究背景
G 蛋白偶联受体 (GPCR) 是细胞和器官之间信息传递的关键调节剂。其中，B1 类 GPCR 被主要肽激素和神经肽激活，它们在代谢、心血管和免疫反应的生理调节中起重要作用。了解天然和合成配体如何与 GPCR 结合，以及激动剂如何激活受体以募集转导蛋白对于理解身体如何调节呈递给不同细胞和组织的复杂信息流以实现协调的生物反应至关重要。尽管结构生物学取得了进展，但因为难以阐明关键中间状态（例如apo 、激动剂结合），我们对实现配体结合和随后的受体激活以及 G 蛋白募集的动态分子过程的理解还不完整。为了解决这一问题，研究者应用了单颗粒冷冻电镜技术(cryo-EM) 来确定降钙素基因相关肽 (CGRP) 受体(CGRPR)（一种 B1 类 GPCR）中间状态的结构。 CGRP 受体是偏头痛病理学中的关键介质，是神经肽 CGRP 作用的主要靶标，CGRP 具有多种生理功能，包括调节血管张力以及调节炎症和代谢反应。
实验方法
CGRPR 是异二聚体，由降钙素受体样受体 (CLR) 和受体活性修饰蛋白 1 (RAMP1) 构成，属于B1 类 GPCR。在昆虫细胞中表达蛋白，收获细胞后冻存。将收获的细胞在 20 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl2 和 3 mM CaCl2 中解冻，并辅以蛋白酶抑制剂、Benzonase（37.5 U/mL，Merck Millipore）和 3C 蛋白酶（ 10 mg/mL；从 CLR 上切割标签），有或没有 1 或 10 mM CGRP（Chinapeptides）。添加LMNG和CHS至最终浓度分别为 0.5% 和 0.03%，并在 4℃ 下 1 小时使目的蛋白溶解。30,000 g 下离心15分钟去除不溶物，取上清室温下2小时结合M1 anti- FLAG affinity resin。装入玻璃柱中并用20个柱体积的 20 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl2、3 mM CaCl2、0.01% (w/v) LMNG和0.0006% (w/v) CHS、含或不含1 mM CGRP洗涤，使用无钙缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、含或不含 1 mM CGRP、0.01%（w/v ) LMNG 和 0.0006% (w/v) CHS、0.2 mg/mL FLAG 肽）洗脱目的蛋白。样品浓缩后，在 Superdex 200 Increase 10/300 柱 (Cytiva) 上进行精细纯化，提前用 20 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2 mM MgCl2、含或不含 80 mM CGRP（以确保高受体占有率）、0.01% (w/v) LMNG 和 0.0006% (w/v) CHS平衡凝胶柱。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
