作者：Kschonsak, M et al.
发表日期：2022年3月
发表期刊：Nature
研究背景
敲除NALCN会导致小鼠产生致命的呼吸节律破坏，而人类的NALCN突变会导致精神、运动和视力的渐进性恶化，并导致早期死亡。NALCN是人类的孤儿基因，代表具有四结构域的离子通道超家族的一个独特分支。NALCN不受膜电位变化的影响，其在异源系统中的强大活性需要FAM155A、UNC79和UNC80的共表达，它们与电压门控钠（NaV）或钙（CaV）辅助亚基无关。单独的NALCN–FAM155A成孔子组件具有关闭状态的S6。UNC79和UNC80的结构和功能是神秘的，但它们被提议与NALCN相互作用。在小鼠中敲除UNC79或UNC80是致命的，而在人类表型NALCN通道病中，敲除UNC80突变是致命的。UNC79（2635残基）和UNC80（3258残基）在大多数动物界都是保守的，但两者都没有显示出与其他蛋白质的强序列或预测的结构相似性。因此，研究人员试图深入了解完整NALCN通道体的结构组装和功能。
实验方法
优化后的人源 NALCN、FAM155A、UNC80 和UNC79的cDNA分别被克隆到 pRK 载体中的CMV 启动子后面。在 NALCN 的 C 端添加2xFlag-Twin-Strep 标签，在 FAM155A、UNC80 和 UNC79 的 C 端添加2xFlag 标签。在Expi293F 细胞 中表达。将 100 克收集的细胞沉淀重新悬浮在 500 ml 含有 25 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、1 μg/ml benzonase、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂缓冲液中。通过均质化裂解细胞，随后通过添加 2% (w/v) GDN 和 0.1% (w/v) cholesteryl hemisuccinate和 0.2 mg/ml porcine brain polar lipid extract (Avanti) 溶解 NALCN 复合物， 4 ℃下温和搅拌 2 小时。超速离心 1 小时沉淀不溶物，收集含有溶解蛋白质的上清液，在 4℃下与 5 ml FLAG resin 结合 1 小时。先用 6 个柱体积的缓冲液 A（6 CV 25 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl 和 0.04% (w/v) GDN）洗涤未结合的蛋白质，然后用 10 CV 补充 500 mM NaCl 和 10 CV添加 5 mM ATP 和 10 mM MgCl2 的缓冲液再次清洗。 NALCN 用补充有 300 μg/ml FLAG 肽的缓冲液5 CV洗脱下来。收集洗脱液与3 ml Strep-Tactin XT 高亲和力树脂结合 3 小时。用 10 CV 纯化缓冲液洗涤未结合的蛋白质，并用 5 CV 补充有 50 mM 生物素的纯化缓冲液洗脱目的蛋白。 NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80-CaM 复合物随后浓缩至 5-10 mg/ml，用已经预先在缓冲液 （25 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl 和 0.01% (w/v) GDN）中平衡好的 Superose 6 Increase 3.2/300 column对样品进行最后的精细纯化。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 29091598 | Superose 6 Increase 3.2/300 | 1 × 2.4 mL |
| 预装柱 | 29401317 | StrepTrap XT | 1 × 1 mL |
| 填料 | 29401326 | Strep-Tactin XT Sepharose | 50 mL |
