作者：Weihong Zeng et al.
发表日期：2021年1月
发表期刊：Signal Transduct Target Ther.
研究背景
由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引起的2019年冠状病毒病 (COVID-19)对公众健康构成持续威胁。由于恢复期患者中存在中和抗体，恢复期血浆输注已被测试为治疗COVID-19重症患者的有希望的疗法。有文献报道发现了一个令人惊讶的早期COVID-19患者的血清IgA抗体反应。然而，相对于其他抗体同种型，IgA抗体对中和病毒的贡献是未知的。作者以高度纯化的SARS-CoV-2刺突受体结合结构域 (RBD)和核衣壳蛋白 (NP)分别用于开发亲和固定柱。分别使用上述制备的柱从50名COVID-19恢复期患者收集的90 mL病毒灭活血清中纯化RBD和NP特异性血清抗体。然后使用仅与IgG结合的蛋白G柱纯化NP或RBD特异性IgG。通过使用抗IgM亲和柱纯化NP或RBD特异性IgM，并通过使用抗IgA亲和珠的下拉进一步纯化IgA。纯化的NP或RBD-IgA、-IgM和-IgG通过用同种型特异性抗体和质谱法进行蛋白质印迹确认。研究结果表明，COVID-19恢复期的血清库在抗病毒活性方面比单个纯化的RBD抗体更有效，这表明病毒上存在其他抗体阻断位点以及不同抗体的累加效应，这提供了理论基础恢复期血清治疗和联合抗体治疗策略。
实验方法
从血清中纯化NP或RBD特异性抗体
- SARS-CoV-2刺突受体结合结构域 (RBD)和核衣壳蛋白 (NP)
在E.coli中表达NP蛋白，破碎的菌体上清首先过5 mL HiPrep IMAC column (Cytiva)进行第一步的粗步纯化，向收集到的样品中加入硫酸铵至浓度0.5 M，然后使用疏水柱以去除样品中的核酸组分。最后使用Superdex-200 Increase 10/300 GL (Cytiva) 对NP蛋白做精纯。
在HEK293细胞中表达RBD重组蛋白 (带有IgG1-Fc)，细胞培养3天后收获，使用Protein A column (Cytiva)从破碎的细胞上清中纯化RBD。 - 制备抗原固定的亲和柱
按照使用手册将NP蛋白或RBD蛋白偶联到CNBr-activated Sepharose 4B填料 (Cytiva)上。 -
纯化IgG、IgM和IgA
向血清样品中加入硫酸铵至终浓度为3M。完全溶解后4℃ 13000 rpm离心30 min。40 mL PBS重悬沉淀后将样品上样至制备好的固定抗原亲和柱。使用0.1 M HAcO线性梯度洗脱样品即可获得含有3种抗体组分的样品。后续可分别使用Protein G column和anti-IgM column对3个组分进行分离纯化。
此法相较于其他结合几种分子筛进行纯化的方法，其回收率高和纯化倍数都高出很多。对其温度和pH曲线进行测定，在30-70℃内可保持50%以上活力，最适酶活温度为50℃，80℃时酶活损失达到95%。最适pH范围为7-8，在pH4-10范围内具有活力。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 28936551 | HisPrep FF 16/10 | 20 mL |
| 预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 24 mL |
| 预装柱 | 17549854 | HiTrap MabSelect PrismA | 5 × 5 mL |
| 填料 | 17043002 | CNBr-Activated Sepharose 4B | 250 g |
| 空柱 | 28988938 | Column XK 16/40 | 16/40 |
