作者：Marina V Goncharuk et al.
发表日期：2020年7月
发表期刊：Protein Expr Purif.

研究背景

作者设计并优化了一种使用大肠杆菌以可溶性形式表达和纯化天然（即无标签）趋化因子 CCL7 的简化方案。对趋化因子受体的配体结合、激活、信号传导和调节有更好的结构理解，对于设计针对异常趋化因子信号引起的人类疾病的潜在治疗干预措施非常重要。探究趋化因子受体结构细节的关键限制之一是大量纯化、均质且功能完整的趋化因子配体的可用性，而市售产品对于深入的结构研究来说价格昂贵。此外，生产均匀同位素标记的趋化因子，例如适合基于核磁共振（NMR）的结构研究的趋化因子，仍然具有挑战性。在此作者使用大肠杆菌表达系统表达和纯化人趋化因子 CCL7 及其同位素标记的衍生物，达到毫克水平。纯化的 CCL7 不仅通过圆二色性和NMR 分析保持了良好折叠的三维结构，而且在细胞系统中还能诱导选定趋化因子受体的异源三聚体 G 蛋白和 β - 抑制蛋白的偶联。比较了组氨酸标记的 CCL7 和天然 CCL7 诱导的环磷酸腺苷（cAMP）反应，发现 CCL7 的 N 末端修饰会损害其功能。作者在此提出的策略可能适用于其他趋化因子，因此为大量生产用于功能和结构研究的趋化因子提供了一种潜在的通用且具有成本效益的方法。

实验方法

为了大规模制备CCL7，作者选择采用两种设计路线， His-CCL7与His-EK-CCL7。两者的表达质粒构建后转入感受态细胞，并进行诱导表达。表达完成后，含有His – CCL7的细胞沉淀重悬于裂解液中，超声裂解，离心过滤后上清加载到Ni Sepharose HP柱上进行亲和层析。亲和层析中洗脱下的结合蛋白经缓冲液稀释加载到Hitrap SP FF阳离子柱上进行第二次纯化。His- EK- CCL7第一步使用Ni Sepharose HP进行亲和层析。洗脱下来的His -EK-CCL7透析后使用肠激酶消化，之后可用到两种方法分离出天然的CCL7。一是加载到Resource S阳离子交换柱用NaCl梯度洗脱，二是加载到Ni Sepharose HP柱上收集流传液。 将纯化出的His-CCL7与天然的CCL7加载到 Superdex 200 Increase 10/300 GL柱，监测洗脱曲线，分析洗脱组份。

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Reference
DOI: 10.1016/j.pep.2020.105617