作者： Mitchell Gulkis et.al
发表日期：2024年2月
发表期刊：Nucleic Acids Research
研究背景
碱基切除修复 (BER)是修复碱基损伤和碱基缺失位点的关键过程，这一过程能够防止 DNA 损伤造成诱变和致死后果。碱基切除修复途径涉及一系列连续的酶解步骤，需要将修复中间产物从通路中的一个酶直接转移到下一个酶，以防止有毒的链断裂中间产物在细胞中积累，这一过程被称为底物-产物通道。BER通过 DNA 连接酶 (LIG) 1 或 LIG3α 完成最终的 DNA 连接步骤，该步骤催化缺口的 3′-OH 和 5′-P 末端之间形成磷酸二酯键。DNA 聚合酶 β (Pol β)会将正确的核苷酸整合到缺口 DNA 中，产生的缺口修复产物，再经过 DNA 糖基化酶和 APE1 的初步损伤识别和处理后，修复产物会被输送到 LIG1 或 LIG3 α，以便于在 BER 途径的下游步骤中进行后续缺口封闭。研究表明，在某些情况下，BER 反应会导致诱变修复，其中与修复通路的 DNA 连接步骤耦合的间隙填充可能会受到影响。
Polβ 是一种易出错的聚合酶，在 BER 期间，大约每 5000 个核苷酸插入事件中就包含一个错配。在人类细胞中，核糖核苷酸三磷酸 （rNTP） 比脱氧核糖核苷酸三磷酸 （dNTP） 丰度高得多，DNA 聚合酶的 rNTP 错误掺入构成了嵌入基因组 DNA 中的核糖核苷酸的主要来源，这可能使磷酸二酯骨架更易受到 DNA 损伤的影响，影响 DNA 构象，增加突变率。然而，核糖核苷酸对下游步骤中 BER 通路协调的影响，涉及通过易错的 polβ 掺入 rNTP 和随后通过 DNA 连接酶进行缺口密封，仍未确定。此外，已发现多种人类肿瘤细胞（如肺癌、胃癌、结直肠癌和前列腺癌）在蛋白质的不同区域携带单个氨基酸突变的 polβ 变体。这些 polβ 癌症相关变体在体外具有异常活性，例如保真度降低，这是由于对错误核苷酸的区分减少，导致突变表型（Y265C 和 E288K），dRP 裂解酶 （L22P） 或聚合酶 （S229L） 活性降低，完全缺乏间隙填充活性 （E295K）。前人研究表明polβ 介导的高保真 DNA 合成在致癌作用中起着关键作用。然而，在 polβ 癌症相关变异介导的间隙未填充的情况下，BER 下游步骤的底物-产物通道的效率如何受到不利影响仍然是未知的。
实验方法
LIG1的表达和纯化：在大肠杆菌中过表达人类野生型his-tag LIG1全长（1-919），并在含有卡那霉素（50 μg/ml）和氯霉素（34 μg/ml）的TB培养基中37℃培养。当 OD600 达到 1.0 时，用 0.5 mM 异丙基 β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导细胞，并在 20℃下继续过表达过夜。离心后，在含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、500 mM NaCl、20 mM 咪唑、2 mM β-巯基乙醇、5% 甘油和 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解缓冲液中裂解细胞。 细胞裂解液在 4℃下以 31 000 × g 离心 90 分钟，之后经过滤澄清后上样到 HisTrap HP 层析柱，该色谱柱之前已用含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、500 mM NaCl、20 mM 咪唑、2 mM β-巯基乙醇和 5% 甘油的结合缓冲液平衡过。用结合缓冲液清洗色谱柱，然后在 4℃ 下用咪唑梯度洗脱（0-500 mM）。收集的组分随后上样到 HiTrap Heparin 柱上，该柱用含 20 mM Tris-HCl（pH 7.0）、50 mM NaCl、2 mM β-巯基乙醇和 5% 甘油的结合缓冲液平衡，蛋白质用最高为 1 M 的 NaCl 线性梯度洗脱。在含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、200 mM NaCl、1 mM DTT 和 5% 甘油的缓冲液中，用 Superdex 200 凝胶过滤层析柱进一步纯化 LIG1 蛋白。
polβ的表达和纯化：将带有 GST 标记的人野生型全长（1-335）polβ（pGEX-6p-1）的 BL21(DE3) pLysS 大肠杆菌中在37℃ 的 TB 培养基过表达。当 OD600 达到 1.0 时，用 0.5 mM IPTG 诱导细胞，过表达在 20℃ 下持续过夜。在含有 1× PBS（pH 7.3）、200 mM NaCl、1 mM Dithiothreitol（DTT）和 1 mM PMSF 的裂解缓冲液中于 4℃ 超声裂解细胞后，将细胞裂解液以 31 000 × g 离心 90 分钟，然后过滤澄清。将澄清的上清液装入 GSTrap HP 柱，用裂解缓冲液洗涤，然后用含有 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 10 mM 还原型谷胱甘肽的洗脱缓冲液洗脱。为了裂解 GST 标记，重组 polβ 蛋白与 PreScission 蛋白酶在含有 1× PBS（pH 7.3）、200 mM NaCl 和 1 mM DTT 的缓冲液中于 4℃孵育 16 小时。Polβ 蛋白随后通过预平衡的 GSTrap HP 层析柱，以去除裂解的标签，然后将不含 GST 标签的蛋白质上样到HiTrap Heparin层析柱上进一步纯化，该色谱柱用含 20 mM Tris-HCl（pH 7.0）、50 mM NaCl、2 mM β-巯基乙醇和 5% 甘油的结合缓冲液平衡。然后用线性梯度洗脱蛋白质，最高可达 1 M NaCl。最后，在含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、200 mM NaCl、1 mM DTT 和 5% 甘油的缓冲液中，用 Superdex 200 凝胶过滤柱纯化 polβ。
推荐产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17524801 | HisTrap HP | 1 x 5mL |
| 预装柱 | 17040701 | HiTrap Heparin | 1 x 5mL |
| 预装柱 | 17528201 | GSTrap HP | 1 x 5mL |
| 预装柱 | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 1 × 24 mL |
