通用问题
首先,填料的使用次数依据不同的目的和条件而有差异,即便是同种填料,寿命也会不同。其次,层析柱的使用寿命受到多种因素影响,包括样品类型、层析介质所在工艺中纯化步骤 ( 捕获阶段寿命短 ) 、层析介质的类型、层析柱的维护、整个层析系统的组成、层析柱的装柱质量和试剂等的质量。如果是用于药品生产目的,一定要规定好寿命,并且经过验证,以支持产品质量是稳定的。
可能原因 :缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞 ;流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。
建议处理方法 :首先将柱子卸下来,确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了 :参考说明书 CIP 操作进行清洁 ;更换层析柱顶端滤膜或超声清洗 (Hitrap,HiPrep 与 Precision Columns 3.2/300 柱型均不能拆卸换膜 ) ;必要时移除层析柱顶端 2-3mm 凝胶,调节 Adaptor消除顶端死体积。部分预装柱,也可以将填料倒出,去除板结或碎填料后,重新装填。测定柱效或重复之前做过的样品。后续注意样品前处理 ( 如核酸的去除、样品缓冲液条件 ) 以及层析柱的日常维护。
一般再生是每个 Cycle 都必须做的,而 CIP 可以在需要消除交叉污染或经过 1-10 个循环后做,消毒一般在更加严格的 GMP 环境中被要求降低生物负荷。特别需要注意,一定用最严格的条件进行这三个步骤,否则填料的功能会较快失去。NaOH 一直被认为能有效去除蛋白和核酸,同时还能灭活大多数的病毒、细菌、酵母、真菌以及内毒素,由于可以同时达到 CIP 和消毒的目的,因此目前的层析系统、柱子和填料一般都设计为耐受高浓度的NaOH。用于清洁的试剂 ( 如 NaOH ) ,在配制好后必须用 0.45 um的膜过滤,否者会对柱子造成二次污染。具体操作参考说明书。对于 CIP 是否足够达到清洁和避免交叉污染的目的,可以通过空白实验 Blank run 检测。另外, Cytiva 预消毒的 Ready To Process 色谱柱,无需 CIP 即可使用,节省了准备时间,加快了工艺流程。
参考如下 :
- 延长超声时间以降低粘度。也可以使用核酸酶如 Benzonase 同时消化 DNA 和 RNA。如果来源是大肠杆菌裂解液,含有大量的DNA,可以用链霉素沉淀等方法,预先去除大量的 DNA。
- 通过层析方法去除 :由于核酸带负电,在阴离子柱上会结合或阳离子柱上流穿,也可以有效去除核酸。
- 去除填料上结合的核酸 : 一般采用 1M NaOH + 1M NaCl 对核酸的去除效果较好。如果核酸的吸附过强,会采用强烈的方法,3M NaCl可去除靠静电吸附的核酸,然后用 1M NaOH分解核酸,之后再用 3M NaCl 清洗。
可能的原因 :环境温度变化 ;缓冲液未经过脱气 ;层析柱连接系统或操作不当。 建议处理方法 :用大量脱气去离子水或 20% 乙醇反向高速冲洗层析柱,直到小气泡被带出 ( 冲洗过程建议在系统连接反压阀之后进行) 。如果大量进气,建议重新装柱。
蛋白样品最大吸收值一般在 280 nm,核酸或病毒在 254 nm或 260 nm ;多肽 215 nm ;多糖 206 nm。
1 ml/min = 在 HiTrap 1 ml 柱子上近似 30 滴 /min ; 5 ml/min =在 HiTrap 5 ml 柱子上近似 120 滴 /min。
色素性质较复杂,可以根据填料的耐受情况,尝试使用高盐、NaOH、有机溶剂(如 30% 异丙醇或乙醇)或酸(如 0.01 M HCl)处理,最好将填料拆出,分别浸泡在不同试剂中。
也可以考虑使用混合试剂进行处理,例如:通过混合8M尿素 + 0.5 M 乙酸 + 2 M NaCl,对于和阴离子交换等介质紧密结合的化合物,通常很有效;或者1 M NaOH混合1-2 M 盐;可以耐受有机溶剂的情况下,尝试1 M NaOH混合20-30%的异丙醇;根据色素的不同性质,也可以尝试不同的去污剂,注意避免操作中产生气泡。 如果去除不掉,可以定期把色素污染部分的填料去除,或验证是否对于样品纯化造成影响。
大部分填料可以在 4-40℃ 储存,或参考说明书。不可以冷冻,注意北方的冬天有时候室温低于零度,运输和储存应避免冻住。储存过程中,注意避免填料干掉,或低温产生气泡。储存液 :对于耐碱的层析介质,可以使用 0.01M NaOH 作为储存液 ;对于不耐碱比如亲和介质,一般是用 20% 的乙醇或 2% 苯甲醇作为储存试剂。具体请参考 Application note 18-1124-57 AI。填料在进行储存的过程中,需要注意污染的问题,因此建议定期更换储存液,在 GMP 环境下,储存条件必须经过验证,以证明可以有效防止生物污染。
- Fronting Peaks 为色谱峰前倾,表示柱子可能装的太紧,建议降低流速 ;样品超载,建议降低上样量 ;填料中形成一条通路(Channeling) 造成部分样品的路径缩短 ;柱子存在污染。
- Tailing peaks 为色谱峰拖尾,表示柱子可能装的太松,建议使用更高流速 ;由于上样 buffer 条件不合适,造成样品没有和填料结合,建议调节上样 buffer 中的 pH 和盐浓度 ;样品太粘稠,可以稀释或更换 Buffer 体系 ;柱子存在污染 ;系统体积大造成峰变宽,检查系统模块、管线和接头。
当比较不同大小柱子的结果时,流速表示为线性流速 (cm/h)比较方便。然而,流速经常测量为体积流速 (ml/min)。为了在线性流速和体积流速之间进行转换,可以使用下面的公式。体积流速 (ml/min)= 线性流速 (cm/h)/60* 柱子横截面积 ( 平方厘米 )。也可以使用在线计算工具 Flow Rate Converter
FF装填的是基架为Fast Flow系列填料,平均粒径为90μm;HP装填的是基架为High Performance系列填料,平均粒径为34μm。在纯化过程中,粒径小的填料,能提供更高的分辨率,峰展宽也更窄,但会带来更高的反压,因此流速更慢,而粒径大的填料反之。
- 无论哪一种纯化方式,我们都需要保证样品可溶无颗粒,因此上样前需要通过离心或者过滤处理,在必要的情况下,需要对样品的稳定性进行测试,以避免纯化过程中发生样品的降解、聚集、变性。
- 在分子筛实验过程中,上样量有严格要求,具体请参考对应柱子的说明书,有推荐最大上样体积,而对于样品的浓度,在高分辨分离时建议不超过10mg/ml的浓度,另外可以通过核酸酶处理降低样品中核酸含量以降低样品的粘度;
- 在其它结合模式纯化(离子交换、AC、HIC等)过程中,我们需要根据载量确定填料用量,而上样体积不是限制因素(因为结合为动态平衡,所以样品浓度对结合效率有一定影响,所以当样品浓度非常低的时候会考虑浓缩后上样);
- 样品的上样条件需要与所选择的纯化方式相匹配,如pH和离子强度。必要时可通过脱盐或者膜过滤等方式对样品的缓冲液条件进行优化;
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产品质检报告COA/COC、Hyclone培养基配方、MSDS、RSF文件下载地址:
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柱效测定的具体方法,请参考填料和预装柱的使用说明书上的标准流程。如没有,可以参考如下方法:
丙酮测试:对凝胶层析柱,亲和层析柱和离子交换柱来说,以1%丙酮作为样品,以水为流动相测定280 nm的紫外吸收值。对疏水层析柱和反向层析柱来说,以1%丙酮溶于20%乙醇溶液作为样品,以20%乙醇为流动相测定280 nm的紫外吸收值。
氯化钠测试:以0.8 M NaCl作为样品,以0.4 M NaCl为流动相测定电导值。两种方法的上样量均为1% CV,使用30 cm/h的流速。
- 1. 将需要测试的层析柱连接到ÄKTA系统上,打开Method Editor窗口,点击File→New method→ Column Performance Test →OK;
图 1 建立柱效测定方法
- 2. 根据所用的预装柱或空柱和填料的类型,来设定压力报警,柱体积,柱位,缓冲液入口,流速(测柱效全程使用30 cm/h 线性流速),平衡时间(至少 1.5 CV),上样体积(1% CV)等信息。随后点击File→Save As来保存该柱效测定方法;
图 2 设定柱效测定方法参数
- 3. 随后将 1% CV 的样品( NaCl或丙酮)注入层析柱,然后自动运行已保存好的测柱效方法;
- 4. 测定结束后在Evaluation窗口打开结果进行柱效分析,在 Curve 窗格中点击右键,选择Customize,去掉不需要显示的曲线;
图 3 勾选柱效测定曲线
- 5. 点击Integrate→Peak Intergrate 进行积分处理,在弹出的Peak Intergrate窗口选择需要积分的曲线以及积分表存储位置,基线类型默认为 Calculate baseline;
图 4 峰积分设置
- 6. 在积分窗口中选择Peak Window,出现以下窗口,通过拖动左右两条直线可以选择需要进行积分的范围,点击OK确认;
图 5 峰积分窗口设置
- 7. 在积分窗口点击 Reject Peaks 对需要分析的色谱峰可进行高级定义,包括最小峰高、峰宽、峰面积、峰个数等,在这里最常用的是在 Peak area is less than 输入需要显示的最大峰的个数,点击 OK 确定;
图 6 峰定义设置
- 8. 在 Column height (bed height) 一栏中输入柱床高度, 在柱效测定中此项必须填写。随后点击OK,查看积分结果;
图 7 峰积分设置
- 9. 在 Peak data 区域点击右键,选择 Customize→ Select peak table columns 对话框中找到需要显示的数据如Plate height(HETP)、 Asymmetry 等,点击 OK 执行,Peak data区域中将会显示增选的分析结果。判断层析柱柱效是否合格的标准是Plates per meter 和 Asymmetry。 Plates per meter要求大于说明书上要求的最低限(如 >3000 或 20000 ),Asymmetry 要求处于 0.8-1.8之间 (图9仅作示例),满足这两点说明层析柱装填没有问题。
图 8 峰积分数据显示
图 9 峰积分数据显示
柱效测定文件:Column efficiency testing-pdf (cytivalifesciences.com.cn)