常见问题
Cytiva提供四种标签纯化产品,包括His标签、GST标签、MBP标签、Strep II标签;
- His标签为最常用,有高载量,操作简便的特点,可实现柱上复性;
- GST标签相对较大,有助溶效果,纯度也较高,一般纯化后需要对标签进行切除,GST标签不可变性上样;
- MBP标签有更显著的助溶效果,一般也需要进行标签的切除;
- Strep II标签属于小标签,一般不需要切除,有着极高的选择性,可与His标签搭配实现双标签。2020年初,Cytiva新上市的Strep-Tactin XT Sepharose,使用新型基因工程改造的Strepavidin作为配基,可以高特异性的结合带有Strep-tag II和Twin-Strep-tag的标签蛋白。
HP: High Performance,高性能,填料平均颗粒大小约34 μm,颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。HP 纯化后峰更窄,样品浓度高,节省了浓缩步骤的时间,但会带来更高的反压,因此流速更慢。Ni Sepharose 6 Fast Flow : Fast Flow,快流速,填料平均颗粒大小约 90 μm,较 HP颗粒粗,具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化,同样适用于重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。如果纯化包涵体蛋白较多,可以优先考虑 FF Crude(预装柱)或 FF。
HisTrap FF Crude 预装柱中的滤膜孔径更大,裂解液无需离心过滤处理,可以直接上样,适合样品不稳定或者比较粘稠容易造成柱子堵塞的料液。例如如果纯化包涵体蛋白较多时,可以优先考虑FF Crude (预装柱)或 FF。
HisTrap excel 最大的特点是镍脱落极低,且能耐受 100 mM EDTA,特别适合真核外泌蛋白(如培养基中含有螯合剂)。无需脱镍,即可直接使用 NaOH 清洗,防止交叉污染且有更长的使用寿命。由于 Ni Sepharose excel 填料对于蛋白的结合较弱(牺牲了载量换取镍的低脱落),因此载量相对较低(约 10 mg/mL),结合缓冲液中无需加入咪唑,但纯化得到的蛋白样品纯度更高。
两者均可以与过渡金属离子螯合,但其配位方式不同。以镍离子螯合为例, Chelating 采用的是 IDA 的配位方式,镍离子可形成六个配位键,其中与基架配基形成三个配位键,剩余三个用于捕获蛋白 ;而 IMAC 则是四个配位键与配基螯合,因此镍离子稳定性更好。两者因螯合方式不同,镍离子结合力也存在细微差距,在对不同蛋白的纯化过程中表现出不同的选择性。
结合缓冲溶液:
- FF、 HP系列: 20mM磷酸钠缓冲溶液, 500mM NaCl(避免非特异电荷吸附), 20-40mM 咪唑(提高浓度,可以增加纯度但会降低收率), pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。
- Talon 系列: 20mM 磷酸钠缓冲溶液, 500mM NaCl, 10-20mM咪唑, pH7.4。
- Excel 系列: 20mM 磷酸钠缓冲溶液, 500mM NaCl, pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑,在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)。
洗脱缓冲溶液:
- 20mM 磷酸钠缓冲溶液, 500mM NaCl, 500mM 咪唑, pH 7.4。
若目的 His 标签蛋白正常表达(使用抗 His 标签的抗体进行 WB 检测)且充分释放至上清中,确认蛋白是流穿还是未被洗脱:
若 His 标签蛋白流穿 :
- 样品或结合缓冲液的条件不合适,注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。
- His 标签蛋白与填料的结合较弱:降低上样流速或增加孵育时间 ;增加标签 His 的数量(常用 6 – 10 个)。
- His 标签未充分暴露:在变性条件(4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍) 下进行纯化或测试;重新构建克隆,改变 His 标签的位置。
- 尝试其他的金属离子:如 锌离子,钴离子等。
若 His 标签蛋白未洗脱:
- 洗脱条件过于温和:增加咪唑浓度或降低洗脱 pH(注意:pH降至 4.0 以下时 Ni2+ 会发生脱落)。
- 目的蛋白与填料发生非特异性疏水或其他相互作用:在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂(如 2% Triton X-100)或提高 NaCl浓度。
- 目的蛋白在填料中发生了沉淀:减少上样量;使用咪唑线性梯度而不是步级洗脱以降低洗脱得到的蛋白浓度;使用去垢剂或改变 NaCl 浓度;在变性条件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍 )下洗脱。
可以考虑以下可能原因与解决方法:
- His 标签蛋白被部分降解:添加蛋白酶抑制剂 (慎用 EDTA) ;保持蛋白样品在低温下操作;缩短实验操作的时间,例如使用crude 系列预装柱省略离心澄清的步骤。
- 杂蛋白对于金属离子也有较强的结合:优化结合、洗脱条件( 咪唑浓度、 NaCl 浓度、 pH 条件等 ) ;尝试不同金属离子螯合的填料 ( 例如 Co2+:HiTrap TALON crude 预装柱和 TALON Superflow 填料);增加后续的纯化步骤,例如离子交换、凝胶过滤等;构建双标签目的蛋白进一步纯化。
- 杂质与目的蛋白存在相互作用而共洗脱:在细胞破碎前加入去垢剂或还原剂;提高 Wash buffer 中去垢剂浓度 (2% TritonX-100 或 2% Tween 20) 或添加甘油 (20% 以内 ) 以破坏非特异性相互作用;将缓冲液的盐浓度提高至 500 mM NaCl。
- 洗杂步骤不够充分:重复洗杂的步骤使洗杂充分。
使用 HisTrap 柱进行柱上复性时, His 标签与金属离子的紧密结合并不会受到变性剂 ( 尿素或盐酸胍 ) 浓度的显著影响,因此在降低变性剂浓度复性的过程中, His 标签蛋白将保持结合。这种结合在除去变性剂时有利于防止聚集体的形成。柱上复性的另一个优点是 :只要在层析介质的结合能力范围内,样品体积没有明显的限制。一般步骤为 :平衡 ( 含有变性剂的平衡缓冲液 )- 上样 - 复性 ( 尿素梯度 )- 洗脱 ( 咪唑梯度 ),具体案例请参考挑战蛋白纯化手册 Purifying Challenging Proteins: Principles and Methods。
如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低,可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点,而通过洗脱液无法彻底清洗所致。建议可以采用不同的清洗方法来提高载量。
(1) 由于 NaOH 清洁效果最佳,一般建议按照说明书中的操作方法先脱镍再进行清洁。首先用 5- 10 倍柱体积的脱镍缓冲液 ( 20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl,50 mM EDTA, pH 7.4 ) 洗涤,进行脱镍操作,然后用 5- 10 倍柱体积的平衡缓冲液冲洗,最后用 5- 10 倍柱体积的双蒸水冲洗 ;随后进行清洗操作:
- 去除离子型杂蛋白,可以用 5 倍柱体积的 1.5 M NaCl 溶液,然后 10 倍柱体积的双蒸水冲洗。
- 去除沉淀或变性蛋白,可以用 1 M 氢氧化钠溶液,接触 1- 2小时,然后用 10 倍柱体积的平衡缓冲液和 10 倍柱体积的双蒸水进行冲洗。
- 去除疏水蛋白或者脂蛋白,可以用 5- 10 倍柱体积的 30% 异丙醇溶液清洗,然后 10 倍柱体积的双蒸水洗涤。
最后进行再生镍操作,用 0.1 M 硫酸镍上柱 ( 至少 0.5 倍柱体积 ),随后 5 倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液进行洗涤,如需保存,保存在 20% 乙醇溶液即可。一般经过 5 – 7 次纯化之后可以进行脱镍、清洁和再生镍的操作。普通 Ni 柱(例如 Ni Sepharose FF 或 HP)不建议在不脱镍的情况下进行 NaOH 清洗,避免游离镍离子产生氢氧化物沉淀。
(2) 如果只需要温和清洁,可以不脱镍:
- 去除沉淀或变性物质,可以尝试用 2 倍柱体积的 6M 盐酸胍或8M 尿素洗涤,然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。
- 去除疏水结合的物质,可以尝试 2 倍柱体积 1% Triton X-100 洗涤,然后用 5 倍柱体积的缓冲液洗涤。
柱子中存在的很少量游离的 Ni2+,会在高 pH 条件下,形成Ni(OH)2 沉淀。使用水或缓冲液冲洗后,可以视情况补充镍并继续使用。为了避免金属盐的沉淀,应尽量避免这种操作。
主要是缓冲液中 DTT 等还原剂的影响,在碱性的缓冲液条件下,镍离子会被 DTT 还原生成棕色的沉淀。如果样品或缓冲液中含有 DTT,在上样之前,建议采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子 ;当不使用时,勿将 Ni Sepharose 填料保存于含还原性试剂的缓冲液中。空白运行方法 ( 使用不含还原剂的平衡液和洗脱液 ):
- 5 倍柱体积的双蒸水洗柱;
- 5 倍柱体积的洗脱液洗柱;
- 10 倍柱体积的平衡液平衡。
如果维护的好的话,填料在其效期之内可以一直重复使用。如果每次都是纯化同样的蛋白,没有必要剥离掉镍离子重新挂镍,一般经过 5 – 7 次纯化之后可以进行脱镍和再生镍的再生操作。如果柱子反压高了,填料需要做彻底的在位清洗 CIP,在清洗之前,为了避免金属盐的沉淀,需要剥离掉镍离子,清洗后再重新挂镍,最后保存在 20% 的乙醇中。
柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂质颗粒所致,所以样品一定要离心,或者用 0.22/0.45 μm 的滤膜过滤。由于 E.coli 裂解液比较难过滤,如果只用 10000 g 的转速离心后直接上柱,对填料损害较大,很容易堵塞柱子。针对这种情况,HisTrap FF Crude 系列预装柱可以允许初处理的裂解液直接上样,减少了操作时间。对于更大规模的样品,可以考虑中空纤维滤柱0.1 – 0.2 μm 孔径进行澄清,否则柱子会因为经常堵塞而报废。如果柱子发生了堵塞,请及时做在位清洗,若不成功,则需要更换填料或者柱子,并在下次上样时优化样品的处理方法。对于预装柱或者是填料,请做好日常的清洗和维护,具体方法请参考说明书。若柱子反压增高了,请进行彻底的在位清洗 CIP。