作者：Tobias Hahn 博士，Cytiva 研发负责人
病毒样颗粒 (VLP) 是一种充满前景的分子形式，可用于开发靶向对抗新型病毒和癌症的疫苗。VLP 的大小和形状使其易于被抗原呈递细胞 (APC) 摄取，从而能有效地诱导适应性免疫反应。
VLP 通过病毒结构蛋白的重组表达获得。大规模生产 VLP 的方法之一是通过悬浮细胞培养来进行生产。从细胞培养上清液中提取 VLP 是一个耗费时间和人力的过程。纯化策略的开发主要通过实验方法进行，即通过实验设计 (DoE) 研究对参数进行优化。该过程需要进行几十次实验以手动选择的方式筛选出工艺设计空间。
相比之下，机理模型使用流体动力学和热力学原理来描述样品组分传输（图 1）。此外，机理模型还可以通过数字模拟对工艺进行高效优化。在本文中，GoSilico™（现为 Cytiva 旗下品牌）和 CEVEC Pharmaceuticals 介绍了 VLP 纯化工艺开发中采用的一种创新方法所取得的结果。
图 1. 机理模型所使用的层析工艺的流体动力学和热力学原理。
材料和方法
VLP 通过病毒结构蛋白的重组表达进行组装。大规模生产 VLP 的方法之一是在悬浮细胞培养中进行表达。使用 CEVEC 的 CAP®Go 平台生产大小约为 40 nm 的黄病毒属 VLP。纯化步骤的第一步是切向流过滤。分离模式选择阴离子交换层析。通过 ÄKTA™ 系统运行层析实验。将层析图谱以及额外的组分分析结果导入 GoSilico™ 层析建模软件进行建模及优化。初始参比层析图谱见图 2。纳米颗粒跟踪分析显示有两种不同的 VLP 变体（图 3）。
图 2. 从 UNICORN™ 软件中导出的初始参比层析图谱。
图 3. 针对进样（左）、第一洗脱峰（中）以及第二洗脱峰（右）的纳米颗粒跟踪分析显示有两种 VLP 变体。
模型校准
最初只记录两种层析图谱，一种为梯度洗脱，一种为逐步洗脱（图 4 和图 5）。仅使用光谱分析，鉴定出了 6 种不同的进样组分。离子交换层析选择径向流层析柱模型和空间质量作用 (SMA) 模型。使用 GoSilico™ 层析建模软件内置的峰检测和参数估算方法进行模型校准。进行不确定性量化（见下文的“模型质量”）后，结合使用逐步洗脱和梯度洗脱完成第一轮数字模拟优化。
图 4. 第一个使用梯度洗脱的实验显示有两个 VLP 峰。
图 5. 通过一次逐步洗脱来确定合适的峰分离度。
基于模型的工艺优化
在初步模型的基础上建立稳健的洗脱条件。为改善基线分离的模型质量，将第一步改为梯度洗脱（图 6）。可去除大部分宿主细胞蛋白，并回收超过 95% 的 VLP。而且，建立的洗脱条件可达到预期的基线分离效果。此外，考虑了第一个峰的流穿情况。使用该设置进行了验证运行，验证结果与模型预测一致（图 7）。
图 6. 完成了稳健的优化，使第一洗脱峰中组分四位置出现移位。电导率迹线以黑色显示，而紫色和淡紫色显示参数优化的两种可能模拟结果。
图 7. 验证运行结果与基于模型的预测结果具有很好的一致性。电导率迹线以黑色显示。模拟结果以紫色显示，验证测量结果以橙色显示。
模型质量
尽管目测模型的拟合度非常好，但只有 95% 置信区间的计算值能提供参数明确与否的相关信息。组分 4（橙色）和 6（粉红色）与产物（绿色）的洗脱峰位置很靠近，组分 4 和 6 测定值的不确定性导致可能出现共洗脱。1000 个样本点的拉丁超立方抽样 (LHS) 产生的层析图谱和收率分布见图 8。
图 8. 组分 4（橙色）和 6（粉红色）的模型参数不确定性导致了优化工艺条件下层析图谱的可变性（未显示 VLP 第一洗脱峰）。产物以绿色显示。
图 9. 通过 1000 个样本点的 LHS 抽样对初始模型的可预测性进行评估。预计收率均值为 93.3%，95% 置信区间为 ± 0.1%。
结论
将有限的实验次数与机理模型相结合，可实现针对 VLP 纯化的高效工艺参数优化和设计空间表征。当前不存在下游平台工艺时，可以采用这种新方法。最终确定的模型能帮助更好地理解产品质量属性及其与工艺参数的关系。这是由欧洲药品管理局 (EMA) 和美国食品药品监督管理局 (FDA) 所制定的“质量源于设计”指导原则中的一项要求。由于机理模型能够预测工艺放大结果，这种能力在新药的早期工艺开发阶段具有非常大的价值，因为此时可供使用的样本量通常很有限。
本案例研究是与 CEVEC Pharmaceuticals GmbH 密切合作完成的。本文的实验数据由 CEVEC Pharmaceuticals 友情提供。