尽管核酸扩增检测 (NAAT) 技术取得了诸多进展，PCR 仍是所有核酸实验室的核心技术。从基础研究到应用研究，PCR 可用于识别、测序或修饰 RNA 和 DNA。
然而，即便是这一成熟方法也可能出现问题。PCR 可能产生非特异性扩增、假阳性、包含不同突变的混合产物，甚至完全无扩增产物。如何在实验中尽量避免这些挑战？PCR 的成功依赖于方法、设计、试剂和仪器的恰当选择。
尝试采用以下 PCR 设计与实施最佳实践，提升您的实验数据质量。
1. 选择最合适的 PCR 方法
PCR 有众多可选方案，包括不同的检测方法，因此很容易让您忽视更适合您应用场景的选项。
常规 PCR
常规 PCR 是一种在反应末端通过嵌入染料（如溴化乙锭或 SYBR™ Green）检测 DNA 存在与否的方法。
作为一种简单且低成本的技术，常规 PCR 可用于克隆或医学中的微生物检测，但它在现代基因组学中同样发挥作用，例如为二代测序 (NGS) 扩增起始材料。
定量 PCR (qPCR)
定量 PCR (qPCR)，也称为实时 PCR (real-time PCR)，通过使用荧光探针，可实现对 DNA 扩增的快速、特异性检测。
借助多重 PCR，您还可以使用不同的引物和探针识别多个 DNA 靶标。使用质量良好的样品在一次反应中同时检测多个 DNA 区域，有助于节省成本，并减少假阴性结果的发生。
对于 RNA，您可以采用一步法或两步法进行定量分析。然而，考虑到多个样品之间可能存在质量差异，一步法更难进行样品间比较，也无法重复失败的 PCR 实验。
表 1.一步法与两步法逆转录 PCR (RT-qPCR) 的优缺点汇总
| 优点 | 缺点 | |
|---|---|---|
| 一步法 RT-qPCR |
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| 两步法 RT-qPCR |
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这两种方法都依赖于高质量且一致性良好的样品提取，理想状态下可减少花在调整和优化逆转录反应上的时间。
直接 RT-PCR 可应对这一挑战，实现无需提取的 NAAT。
数字 PCR
数字 PCR (dPCR) 是 PCR 方法的最新进展之一。该方法将 PCR 溶液分隔为数万个纳升级的液滴，每个液滴中进行独立的 PCR 反应。
数字 PCR 能够检测更小的变异或低频事件，且比 qPCR 更能抵抗抑制剂的影响。它特别适合检测罕见突变、SNP 或基因编辑事件。但由于不依赖建立标准曲线，相较于 qPCR，它不太适合用于病原体检测或基因表达研究。
2. 制备高质量核酸
PCR 的质量与所用核酸的质量密切相关。自制试剂可以获得良好的提取质量，但商用试剂盒能减少操作差异，并标准化提取工艺，即便是微量样品也能获得高收率。
无论使用哪种方法，都可能会带入影响或抑制 PCR 的杂质。例如，苯酚会降解聚合酶，而从 Tris-EDTA (TE) 缓冲液中带入的乙二胺四乙酸 (EDTA) 可能螯合反应中的镁离子，从而降低聚合酶活性。
低质量的提取方法还可能残留核酸酶，导致样品降解。因此，记得使用分光光度法检测 A260/280 比值：纯 RNA 应约为 2.0，纯 DNA 应约为 1.8。若该比值偏低，可能表示存在盐、苯酚或蛋白质等杂质。
优化提取步骤、选择合适的洗脱缓冲液，有助于应对上述挑战。
您还可以通过直接 RT-PCR 解决核酸提取相关问题。该方法无需单独的核酸提取步骤，不仅可缩短检测时间、提升通量，还能实现从未纯化样品中快速、准确、灵敏地检测病毒 RNA，例如从鼻咽拭子中检测 SARS-CoV-2 病毒 RNA。
图 1.依赖核酸提取的 RT-PCR 与直接 RT-PCR 的流程比较。
我们的直接 RT-qPCR 主混液试剂盒包含抗抑制剂复合物 (AIC)，可在裂解样品的同时保护 RNA 完整性（图 1）。
了解直接 RT-qPCR 主试剂盒，实现免提取 RNA 分析
3. 花时间设计合适的引物和探针
设计理想的引物并不简单。遵循一些基本规则有助于避免引物自退火、形成引物二聚体，或引物对间的熔解温度 (Tm) 差异过大等问题。
多种在线引物设计工具可帮助您识别序列中可能存在的这些问题。
那么，引物设计的规则有哪些？
理想引物应具备以下特征：
- 为短链 (15-30 kb) 的寡核苷酸序列。
- 对靶区具有高度特异性。
- 重复核苷酸序列极少。
- GC 含量较低(< />
适应高 GC 含量
鸟嘌呤-胞嘧啶 (GC) 含量是重要的考量因素，因为 GC 含量高会导致键合稳定性增加，会提高引物的熔点，从而容易引发二级退火。
如果模板本身富含 GC，可选择专为此类模板优化的反应主混液。这类主混液通常含有二甲基亚砜 (DMSO) 等添加剂，并配备优化的聚合酶。
利用剪接位点
在研究 RNA 时，需先合成 cDNA。但如何避免扩增样品中污染的 DNA？
虽然可以使用 DNase I 等核酸酶处理样品，但这种方法可能无法完全去除 DNA 污染。因此，您可以考虑设计跨越外显子-外显子连接位点的引物。这种设计能确保只扩增 cDNA，同时也便于分析特定的剪接变体。
同样地，在研究 DNA 时，也可设计跨越外显子-内含子连接位点的引物，结合使用 RNase，以避免扩增污染的 RNA。
4. 寻找最适用的探针
嵌入染料
使用嵌入染料（如经典的溴化乙锭）染色凝胶，是检测常规 PCR 的常用方法。溴化乙锭成本低、灵敏度高，且操作简便。
不过，使用嵌入染料时需要注意一个问题：当目标模板丰度较低时，可能会形成非特异性产物，从而增加背景信号。以 SYBR Green 为例，当浓度超过一定阈值时，该染料还可能抑制 PCR 反应。
一种可替代的选择是 EvaGreen™ 染料，它经过设计，具有较低的背景信号和更高的信号强度，同时对 PCR 的抑制作用也更小。这些特性使其非常适用于高分辨率基因分型等高灵敏度应用。
荧光探针
在设计 qPCR 实验时，您可以选择多种带荧光标记的寡核苷酸探针，包括水解探针、分子信标探针以及双重杂交探针。在所有类型中，探针应靠近引物之一，且 Tm应比引物略高（高出 6-8°C），同时具有较低的 GC 含量。
那么，对于 qPCR 而言，嵌入染料和荧光探针哪种更好？可参考表 2 中的优缺点比较。
尽管荧光探针的设计相对复杂，但各种在线工具能大大简化此过程。您可以根据 qPCR 循环仪制造商为特定仪器所校准的染料选择，设计双工实验。例如，发射波长为 517 nm 的 6-FAM 标记探针可与 Cy™ 3 (564 nm) 或 Cy™ 5 (670 nm) 标记探针复用。但若将 6-JOE (548 nm) 标记的探针与 Cy™ 3 标记的另一探针复用，可能会导致信号色度亮度干扰，从而影响数据分析的准确性。
表 2.qPCR 中嵌入染料与荧光探针的优缺点比较
| 优点 | 缺点 | |
|---|---|---|
| 嵌入染料 |
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| 荧光探针 |
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5. 请勿忽视反应中的其他试剂！
主混液试剂盒已对 DNA 扩增的基本组分进行了预优化，但当 PCR 反应失败时，仍有必要逐一评估各试剂对特定反应体系的影响。
典型的主混液包含：
- DNA 聚合酶
- dNTPs
- MgCl2
- 缓冲液（含任何添加剂）
DNA 聚合酶
Taq DNA 聚合酶是最常用的一种聚合酶，广泛应用于各种常规 PCR 实验。尽管缺乏校对能力，但 Taq 聚合酶仍是 qPCR 实验的良好起点。
但如果您要扩增 GC 含量较高的区域，可尝试专为此类难扩区域设计的聚合酶，例如 Pfu DNA 聚合酶。
同样地，如果遇到非特异性扩增的问题，可以选择热启动型聚合酶。这类聚合酶在低于其最佳反应温度时处于非活性状态，有助于在设置阶段减少非特异性扩增。
dNTPs
在常规反应中，核苷酸通常等摩尔加入。但在随机诱变等应用中，可能会使用不平衡的 dNTP 浓度以促进错误插入。
在常规使用中，dNTP 的推荐浓度为 0.2 mM。若需提高MgCl2浓度，则应相应提高 dNTP 浓度。但需确保主混液中的 dNTP 浓度不低于 0.01 mM，以免影响 PCR 扩增效率。
MgCl2
镁是 DNA 聚合酶和引物杂交的关键辅助因子。因此，可通过调整其浓度来优化 PCR 效率。
推荐初始浓度范围为 1-4 mM，随后按梯度微调。镁浓度过低可能导致 PCR 扩增产物极少或无产物；而浓度过高则可能导致反应中出现非特异性产物。
缓冲液和添加剂
缓冲液为 DNA 聚合酶提供适宜的化学反应环境，并能减少 DNA 损伤。
例如，二甲基亚砜 (DMSO) 是常见的添加剂之一，可用于降低 GC 含量高区域引发的二级结构的形成。
6. 提高 GC 含量区域的扩增效率
为便于扩增 GC 含量高的区域，可尝试以下几种方式：
- 提高熔解温度（但需注意，聚合酶在超过 95°C 时可能会加速变性）。
- 通过MgCl2滴定进行 PCR，优化目标序列的最佳浓度。
- 添加有助于减少二级结构形成的添加剂，例如：
- 3–10% DMSO
- 1.25% 甲酰胺
- 5% DMSO 和 1.25% 甲酰胺
- 甜菜碱（终浓度 2.2 M）
- 乙二醇（终浓度 1.075 M）
- 1,2-丙二醇（终浓度 0.816 M）
此外，更简便的方法是选择针对难扩区域优化的稳健商业化主混液试剂，例如 Cytiva 的 RT-qPCR 试剂盒。此类主混液含有经过优化的试剂组合，可显著提高扩增效率。
以我们的产品为例，Cytiva RT-qPCR 主混液采用冻干形式提供，便于储存和使用。
7. 设置合适的对照组
确保实验中设置了所有必要的对照，包括：
- 阴性对照：例如，无核酸酶的水，替代模板 DNA。
- 阳性对照：已知含有目标序列的样品。
- 无 RT 对照：用于评估样品中是否存在污染性核酸。
- 管家基因：作为内源性参考，用于校正样品间的差异。
如果您正在排查反应失败的原因，在样品中加入外源阳性对照是一种有效方法，可用于判断是否存在影响 PCR 的抑制因子。
8. 检查可用的设备和耗材
热循环仪在 PCR 循环的每一步中负责对样品温度的精准和可重复升降温操作。这些仪器可能采用加热模块或热风系统，实现对反应管的快速加热与冷却。
不同型号在升温速率和温度均一性方面的性能各不相同，因此务必确认其是否符合您的实验需求。例如，升温速率可能会影响非特异性产物的生成。
部分 PCR 仪器配备梯度功能，可用于优化每个目标反应的温度设置。您可以评估整个模块的温度均一性，以判断其是否会影响实验结果，因为模块边缘较低的温度可能导致 PCR 结果出现差异。
最佳实践助力可靠 PCR 结果
尽管 PCR 技术已有数十年历史，科学家仍在不断拓展其应用边界。请参考我们的最佳实践建议，设计并优化您的 PCR 以实现最佳结果。如果您遇到意料之外的实验结果，也可回顾此清单，确保已为 PCR 成功做出最合适的选择。
在 Cytiva，我们提供广泛的 DNA 样品制备和 PCR 解决方案。如需了解最新动态、技巧和见解，欢迎访问我们的基因组学博客。如您在实验流程中任何环节需要支持，请联系我们的科学支持团队。