摘要

细胞培养基的质量和含量会直接影响解冻细胞的研究结果。因此，根据细胞类型和细胞培养应用选择适合的基础培养基至关重要。在本研究中，我们购买了不同组织的 ATCC 贴壁哺乳动物细胞系 – MDCK、NIH 3T3、HEK 293、MCF 7 和 A549。我们按照供应商的建议，使用含有 HyClone 血清和其他补充剂的 HyClone™ 经典培养基对各种细胞系进行培养。在研究的第一阶段，我们对细胞生长动力学、细胞活力和细胞形态特征进行追踪。然后在含 HyClone™ 血清的 HyClone™ 培养基中直接解冻这些细胞系，确定最佳的细胞接种密度和培养程序。在研究的第二阶段，我们对冻融后的以下参数进行了三次平行研究：细胞生长动力学的可靠性和可重现性；细胞活力；细胞形态。结果表明，这 5 种细胞系在含 HyClone™ 血清的 HyClone™ 经典培养基中的细胞生长都非常稳健。此外，通过在培养基中直接驯化（即将 ATCC 小瓶中的细胞置于 HyClone™ 培养基中直接解冻），细胞生长同样非常稳健。

材料和方法

细胞系和培养基详细信息

所有细胞类型的详细信息见表 1。

表 1. 细胞系和培养基详细信息


第 1 部分：评价培养基直接驯化

解冻细胞

迅速解冻小瓶中的细胞，并将细胞悬液转移至含 9 mL 预热培养基的试管中，如表 1 所示的相关细胞系。然后以 125 × g 的离心力离心分离试管 7 min，将细胞团块重悬于 5 mL 完全培养基中，并转移至 T25 培养瓶中。将培养瓶置于 5% CO2、37°C 下的培养箱中。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度，直至培养结束。

细胞计数和倍增时间

首先通过手动台盼蓝细胞计数法确定活细胞数。同时将该方法与自动台盼蓝计数方法 (Vi-CELL™ XR, Beckman Coulter) 进行比较，设置见 Vi-CELL™ XR 设置部分。在研究的剩余时间中，选择自动 Vi-CELL™ XR（主要在第 3 次传代后）测定活细胞密度 (VCD)（参见选择细胞计数方法部分）；在倍增时间计算中使用这些计数。

按照图 1 所示公式计算细胞倍增时间。

图 1. 细胞倍增时间计算公式。

绘制计算值-传代数曲线图。此外，在传代结束前还通过显微镜观察对细胞形态进行了追踪。

选择细胞计数方法

可通过几种不同的方法测定哺乳动物培养物的活细胞密度 (VCD)，包括台盼蓝拒染法。该方法的原理是活细胞具有完整的细胞膜，可阻挡台盼蓝等染色剂进入细胞内。相反，死细胞失去了细胞膜完整性，染色剂会通过细胞膜渗透至细胞内，使死细胞变成蓝色。可通过手动（例如血细胞计数器）或自动方法（例如 Vi-CELL™ XR）进行台盼蓝法。由于手动台盼蓝法所需的样本体积非常小（例如，10 μL），当细胞数量和培养物体积较小时，可在最初几次传代时使用该方法。然而，由于自动方法可降低操作者的差异，因而是首选方法。因此，当细胞数量增加时，我们选择在后续传代时采用该方法。值得注意的是，细胞密度和活力测定设置对于获得准确的细胞数至关重要。因此，必须根据特定细胞类型调整这些设置（即细胞亮度、清晰度、直径）。

Vi-CELL™ XR 设置

如上一节所述，设置对于获得准确的细胞计数至关重要。本研究中使用的设置见表 2。

表 2. Vi-CELL™ XR 设置


传代培养程序

我们已通过第一阶段研究确定了各细胞类型的最佳培养程序，详见表 3。大致步骤是，去除培养基，并用 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。去除 PBS（磷酸盐缓冲液）后，添加 2 至 4 mL HyClone™ Trypsin-乙二胺四乙酸 (EDTA) (Cytiva; SH30042.02)，并将细胞置于 37°C 下直至其分离。将新培养基添加至细胞悬液中，然后采集样本以进行细胞计数。按照表 3 中推荐的接种密度和工作体积在新培养瓶中接种细胞。如果孵育期较长，更换培养基对一些细胞系有益，如表 3 所示。

冷冻细胞

将 5% DMSO 添加至含相应完整培养基的管中，制备冷冻培养基（见表 1）。对细胞进行胰蛋白酶处理和计数。计算适当数量的细胞，并以 125 × g 的离心力离心分离 7 min。在冷冻培养基中重悬细胞，使密度达到 2.5 至 5 个活细胞/mL。在每个冷冻管中添加 1 mL 细胞悬液，将小瓶置于冷冻装置中并在 -80°C 下放置过夜，然后移至 -150°C 冷冻柜中。

表 3. 细胞传代培养程序


第 2 部分：评价可靠性和可重现性

在本阶段研究中，使用 ATCC 推荐的培养基作为对照，通过对各条件进行三次平行研究，进一步研究各细胞类型的细胞生长、倍增时间、活力和细胞形态的可重现性。使用研究第一阶段制备的细胞储备液和确定的最佳接种密度（表 3）。大致步骤是，解冻 3 小瓶各细胞类型的细胞，置于该细胞系的指定 HyClone™ 培养基和血清中。在三次平行测定条件下，在工作体积为 20 至 25 mL 的 T75 培养瓶中解冻细胞，并置于 5% CO2 下的 37°C 静态培养箱中。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度。按照表 3 所列对细胞进行传代。

结果 – HEK293

其他细胞类型的结果见本页底部。

第 1 部分：评价培养基直接驯化

按照材料和方法所述进行 HEK 293 细胞的第一次解冻，置于含 EBSS、L-谷氨酰胺 (SH30024.FS) + 1% HyClone™ NEAA (SH30238) + 10% HyClone™ 优级胎牛血清 (FBS)（美国来源）(SH30071.03) 的 HyClone™ MEM 培养基中。我们在解冻时对细胞进行计数，确定结果为 0.48 × 106 个活细胞，解冻后活力为 54%。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度（图 2）。我们在第 1 和 2 天观察到许多浮动的细胞。因此，我们在第 2 天时更换了培养基。在第 3 天细胞汇合度达到 80% 至 90% 时，进行了第一次传代。

图 2. 在含血清的 HyClone™ 培养基中直接解冻后 1、2 和 3 天时 HEK 293 的细胞形态和汇合度。

解冻后，每 3 至 4 天进行一次细胞传代，直至第 14 次传代。倍增时间和活力见图 3A。当细胞达到第 8 次传代、第 15 世代时（注意，从购得的 ATCC 小瓶中进行直接细胞解冻后，认为代次为 0），使用 400 万个活细胞（MVC/小瓶）制备用于第二阶段研究的细胞储备液。代表性的细胞形态图像见图 3B。

图 3.A) 从解冻至第 14 次传代的 HEK 293 细胞倍增时间和活力。B) 不同传代时 HEK 293 的细胞形态和汇合度。所有图像的比例尺均为 240 μm，图像是使用 10× 物镜拍摄的。

图 3A 中剔除了第 1 次传代的倍增时间，原因是细胞解冻后的浮动细胞导致初始接种密度测定不准确。初始解冻细胞时，使用手动台盼蓝法计算总 VCD，然后根据该计数计算活细胞接种密度/cm2。恢复后 3 天时，测定总活细胞数和活细胞数/cm2，以计算倍增时间。然而，由于细胞解冻后部分细胞未附着在瓶壁上并在培养基更换期间被洗掉，恢复后 3 天时测定的 VCD/cm2 值与第 0 天接种密度值基本相同。据此得出了负倍增时间值，该值未精确反映细胞生长动力学特征。如图 2 所示，在解冻后 3 天结束时，附着细胞生长并达到汇合状态。

第 2 部分：评价可靠性和可重现性

细胞解冻后，以一式三份培养物的形式保存 HEK 293 细胞，从大约第 15 世代、第 9 次传代开始，直至它们达到第 18 次传代、第 44 世代。在整个约 34 天的培养期间监测细胞的形态（图 4A-C）。一式三份培养物的活力均高于 96%（图 4D）。从第 10 次传代开始，培养物的平均倍增时间约为 28 h（图 4D）。


图 4. A) HEK 293 细胞解冻后的细胞形态。B) 接种密度为 15,000 个细胞/cm2 时 HEK 293 细胞的每日图像。C) 第 18 次传代时 HEK 293 的细胞形态。D) 一式三份 HEK 293 细胞第 9 至 18 次传代的倍增时间和活力曲线。

讨论

在研究的第一阶段，我们建立了细胞培养程序，并确定了所有细胞类型的最佳细胞接种密度。根据这些培养程序进行第二阶段研究，并确定细胞系在其给定含血清 HyClone 培养基中的倍增时间，如表 4 所示。

表 4. 研究第二阶段中不同细胞系的平均倍增时间

群体倍增时间与 ATCC 网站信息和/或文献研究 (1-6) 一致。

结论

  • 从第二次传代开始，细胞系 HEK 293、A549、NIH 3T3、MDCK 和 MCF 7 在其给定 HyClone™ 培养基和血清中的倍增时间分别为 28、23、16、20 和 55 h。此外，三次平行研究表明，在冻融后细胞的细胞生长动力学和活力具有可重现性。
  • 总之，本研究表明，HyClone™ 经典培养基和血清无需事先驯化即可用于给定 ATCC 哺乳动物细胞的常规细胞培养应用。

参考文献

  1. American Type Culture Collection. SOP: Thawing, Propagating and Cryopreserving of NCI-PBCF-HTB22 (MCF-7), February 27, 2012; Version 1.6
  2. Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures.Cell line data on MCF7. https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-115?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=192. Accessed November 15, 2021.
  3. Cho MJ, Thompson DP, Cramer CT, Vidmar TJ, Scieszka JF. The Madin Darby canine kidney (MDCK) epithelial cell monolayer as a model cellular transport barrierPharm Res. 1989 Jan;6(1):71-7. doi: 10.1023/a:1015807904558
  4. American Type Culture Collection. A549 doubling time Info: https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CCL-185.aspx?geo_country=gb#specifications. Accessed November 15, 2021.
  5. CLS Cell Lines Service GmbH. HEK 293 Doubling time info: https://www.clsgmbh.de/pdf/hek293.pdf. Accessed November 15, 2021.
  6. Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. Cell line data on NIH 3T3. https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-59.Accessed November 15, 2021.
  7. Lugovtsev VY, Melnyk D, Weir JP. Heterogeneity of the MDCK cell line and its applicability for influenza virus research. PLoS One, 2013 Sep 13;8(9):e75014. doi: 10.1371/journal.pone.0075014
  8. American Type Culture Collection. NIH 3T3 cells. https://www.atcc.org/products/crl-1658.
  9. Accessed November 18, 2021.Yao T and Asayama Y. Animal-cell culture media: History, characteristics, and current issues. Reprod Med Biol. 2017;16:99–117. doi: 10.1002/rmb2.12024

TR29476099 CY25041

第 1 部分：评价培养基直接驯化

按照材料和方法所述进行 MDCK 细胞的第一次解冻，置于含 EBSS、L-谷氨酰胺 (SH30024.FS) + 10% HyClone™ 优级胎牛血清 (FBS)（美国来源）(SH30071.03) 和 1% HyClone™ NEAA 的 HyClone™ MEM 培养基中。我们在解冻时对细胞进行计数，确定结果为 0.39 × 106 个活细胞，解冻后活力为 66%。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度（图 5）。在细胞解冻后一天，我们观察到一些浮动的细胞。因此，我们在第 2 天时更换了培养基。在第 3 天细胞达到汇合状态时进行了第一次传代。

图 5. 在 HyClone™ 培养基中直接解冻后 1、2 和 3 天时 MDCK 的细胞形态和汇合度。

解冻后，每 3 至 4 天进行一次细胞传代，直至第 14 次传代。倍增时间和活力见图 6A。当细胞达到第 8 次传代、第 20 至 25 世代时，使用 5 MVC/小瓶制备用于研究第二阶段的细胞储备液。此外，使用约 2 MVC/小瓶制备了第 2 次传代时的中期细胞库。代表性的细胞形态图像见图 6B。

图 6. A) 从解冻至第 14 次传代的 MDCK 细胞的倍增时间和活力。B) 不同传代时 MDCK 的细胞形态和汇合度。所有图像的比例尺均为 240 μm，图像是使用 10× 物镜拍摄的。

研究期间，通过光学显微镜观察所有细胞系的形态，以追踪传代期间的模式。我们注意到，随着细胞传代数的增加，MDCK 细胞易于发生形态变化。正常情况下，MDCK 细胞具有异质性细胞形态，包括“岛状”结构和单细胞。然而，在第 5 次传代后，岛状细胞形态开始减少，并且单细胞形态在培养物中变为主要特征（图 6B）。当细胞达到第 8 次传代时，岛状形态大幅减少。文献中还提到 MDCK 细胞易于发生形态变化 (7)。为对此进行进一步研究，我们将一小瓶处于早期传代 (P2) 状态的冷冻 MDCK 细胞解冻，并追踪若干次传代期间的细胞形态。同样，我们观察到在第 4 次传代后 MDCK 的细胞形态在更大程度上趋向于单细胞群（图 7A）。

在观察到形态变化的同时，我们还注意到，随着传代数的增加，MDCK 细胞的倍增时间略有增加，最终在第 10 至 11 次传代时达到约 50 h（维持培养）（图 6A）。据推测，倍增时间和形态变化的增加可能是接种密度所致。因此，针对不同的细胞接种密度进行了试验，以确定 MDCK 细胞形态和倍增时间是否会受到影响。首先，从第 2 至 4 次传代时使用 40,000 个细胞/cm2 的接种密度进行 3 天培养（图 7B 中的黄线），然后在后续第 5、6 和 7 次传代时，将这些特定培养物的接种密度降至 10,000。我们观察到这些培养物在第 3 和第 4 次传代时的倍增时间为 40 h，而从第 5 次传代开始，倍增时间降至 20 至 25 h（图 7B）。本实验证明，3 天培养确实需要较低的接种密度，如 10,000 个细胞/cm2，因为使用这些接种密度时，倍增时间达到了 20 至 25 h 的预期倍增时间。此外，从开始时以 10,000 个细胞/cm2 的密度接种的细胞（图 6B 绿色）的预期倍增时间为 20 至 25 h。

图 7. A) P2 细胞储备液解冻后 MDCK 的细胞形态。B) 以不同初始接种密度接种的 MDCK 细胞的倍增时间。绿线：连续接种密度 10,000 个细胞/cm2。黄线：p2-4 接种密度为 40,000 个细胞/cm2，p5-7 接种密度为 10,000 个细胞/cm2

此外，我们观察到 MDCK 细胞迅速消耗培养基，培养基的颜色在培养后 4 天内变为橙黄色（我们在本研究中包含的其他细胞系中未观察到这种情况）。根据该信息，我们建立了 MDCK 细胞的特殊培养程序，即使用 7000 个细胞/cm2 的接种密度进行 4 天培养，在第 2 天更换培养基；使用 12,000 个细胞/cm2 的接种密度进行 3 天培养，无需更换培养基。使用这些培养程序时，细胞在第 12、13 和 14 次传代期间的倍增时间为 20 至 25 h（图 6A）。细胞形态也发生了变化，出现更多“岛状”细胞形态（图 6B 第 12 和 13 次传代）。这些结果表明，MDCK 细胞易于发生形态变化，但在转换至更有利的培养条件后，该变化是可逆的。此外，还表明最佳细胞接种密度对于这些细胞达到预期倍增时间至关重要。

第 2 部分：评价可靠性和可重现性

细胞解冻后，以一式三份培养物的形式保存 MDCK 细胞，从大约第 21 世代、第 9 次传代开始，直至它们达到第 20 次传代、第 54 世代。在整个 40 天培养期间监测细胞培养物的形态（图 8A-C）。一式三份培养物的活力均高于 99%（图 8D）。从第 10 次传代开始，培养物的平均倍增时间约为 20 h（图 8D）。

图 8. A) MDCK 细胞解冻后的细胞形态。B) 接种密度为 7000 个细胞/cm2 时 MDCK 细胞的每日图像。C) 第 19 次传代时 MDCK 的细胞形态。D) 第 9 至 20 次传代的一式三份 MDCK 细胞的倍增时间和活力曲线。

第 1 部分：评价培养基直接驯化

按照材料和方法所述，对 NIH 3T3 细胞进行第一次解冻，置于含 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠 (SH30243.01) + 10% HyClone™ 补铁小牛血清（美国来源）(SH30072.03) 的 HyClone™ DMEM/高葡萄糖培养基中。我们在解冻时对细胞进行计数，确定结果为 0.07 × 106 个活细胞，解冻后活力为 50%。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度（图 9）。如第 1 至 4 天的图像所示，初始恢复速度非常缓慢，很可能是细胞瓶中的细胞数量较低 (0.5 MVC) 所致。我们在第 4 天时更换了培养基，并在第 6 天细胞达到汇合状态时进行了第一次传代。

图 9. 在 HyClone™ 培养基中直接解冻后 1 至 6 天时 NIH 3T3 的细胞形态和汇合度。

解冻后，每 3 至 4 天进行一次细胞传代，直至第 15 次传代。倍增时间和活力见图 10A。当细胞达到第 5 次传代、第 16 世代时，使用 3 MVC/小瓶制备用于研究第二阶段的细胞储备液。代表性的细胞形态图像见图 10B。形态与供应商网站图片中的形态一致 (8)。

图 10. A) 从解冻至第 15 次传代的 NIH 3T3 细胞的倍增时间和活力。B) 不同传代时 NIH 3T3 的细胞形态和汇合度。所有图像的比例尺均为 240 μm，图像是使用 10× 物镜拍摄的。

第 2 部分：评价可靠性和可重现性

细胞解冻后，以一式三份培养物的形式保存 NIH 3T3 细胞，从大约第 16 世代、第 6 次传代开始，直至它们达到第 20 次传代、第 90 世代。在整个 52 天培养期间监测细胞培养物的形态（图 11A-C）。一式三份培养物的活力均高于 98%（图 11D）。从第 6 次传代开始，培养物的平均倍增时间约为 16 h（图 11D）。


图 11. A) NIH 3T3 细胞解冻后的细胞形态。B) 接种密度为 3000 个细胞/cm2 时 NIH 3T3 细胞的每日图像。C) 第 20 次传代时 NIH 3T3 的细胞形态。D) 第 6 至 20 次传代的一式三份 NIH 3T3 细胞的倍增时间和活力曲线。

第 1 部分：评价培养基直接驯化

按照材料和方法所述进行 MCF 7 的第一次解冻，置于含 EBSS、L-谷氨酰胺 (SH30024.FS) + 10% HyClone™ 优级胎牛血清 (FBS)（美国来源）(SH30071.03) 与 1% HyClone™ NEAA 和 0.01 mg/mL 胰岛素的 HyClone™ MEM 培养基中。我们在解冻时对细胞进行计数，确定结果为 0.68 x 106 个活细胞，解冻后活力为 72%。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度（图 12）。如解冻后图像所示，最初的恢复速度较为缓慢。因此，我们在第 2 天向培养瓶中添加了额外的培养基以促进细胞生长。我们同时观察到呈悬浮和贴壁形式的细胞。尽管细胞未达到汇合状态，但在第 4 天以 1:2 的比例对其传代。

图 12. 在 HyClone™ 培养基中直接解冻后 1 至 4 天时 MCF 7 的细胞形态和汇合度。

解冻后，每 3 至 4 天进行一次细胞传代，直至第 9 次传代。倍增时间和活力见图 13A。当细胞达到第 6 次传代、第 12 世代时，使用 5 MVC/小瓶制备用于研究第二阶段的细胞储备液。代表性的细胞形态图像见图 13B。

我们观察到，与所有其他细胞系相比，MCF 7 细胞生长相对缓慢，倍增时间约为 40 至 60 h。该观察结果与既往研究的结果一致 (1, 9)。MCF7 细胞由于为团块状，其传代具有挑战性。这些细胞在接收时即为贴壁和悬浮细胞的混合细胞群。ATCC 建议谨慎对其传代，以避免悬浮细胞损失。因此，在传代期间，采集细胞上清液，置入 50 mL 试管中，并将胰蛋白酶化细胞添加至同一试管中。然后，以 125 × g 的离心力离心分离细胞 7 min，并重悬于新鲜培养基中进行细胞计数。通过这种方式，我们可避免损失悬浮细胞团块。此外，ATCC 表示，经过数次传代后，细胞将附着在培养瓶上，并且这些细胞将越来越多地成为贴壁型细胞。这一说法与我们观察到的显微镜检查图像的结果一致。

此外，MCF 7 细胞的聚集性质也对 VCD 测定的准确性提出了挑战。如 Vi-CELL™ 图像所示（图 13C），经过胰蛋白酶化处理后 MCF 7 细胞不完全为单细胞悬液状，在细胞计数测定期间仍存在一些细胞团块。因此，为了减少聚集，我们尝试了不同的策略，例如以更大的力度上下移动来移取培养物，或用 21G 针头对培养物进行均质化处理。这些大力度方法增加了处于单细胞悬液状态的细胞部分，但细胞活力有所降低（未显示数据）。因此，我们并未选择这些大力度方法。这些挑战可能会影响细胞计数的准确性。

图 13. A) 从解冻至第 9 次传代的 MCF 7 细胞倍增时间和活力。B) 不同传代时 MCF 7 的细胞形态和汇合度。所有图像的比例尺均为 240 μm，图像是使用 10× 物镜拍摄的。C) 经过胰蛋白酶处理后的 MCF 7 细胞悬液；Vi-CELL™ XR 图像。

出于多个原因，从图 13A 的图表中排除了第 1 和 2 次传代的倍增时间。首先，由于解冻后得到的是异质性细胞群（浮动的悬浮细胞和贴壁细胞的混合物），初始接种密度测定并不准确。此外，由于细胞为团块状，也对细胞接种密度的精确测定造成了挑战，特别是在最初 2 次传代时使用手动台盼蓝细胞计数法的情况。

第 2 部分：评价可靠性和可重现性

细胞解冻后，以一式三份培养物的形式保存 MCF 7 细胞，从大约第 12 世代、第 7 次传代开始，直至它们达到第 15 次传代、第 31 世代。在整个 42 天培养期间监测细胞培养物的形态（图 14A-C）。一式三份培养物的活力均高于 96%（图 14D）。从第 8 次传代开始，培养物的平均倍增时间约为 55 h（图 14D）。


图 14. A) MCF 7 细胞解冻后的细胞形态。B) 接种密度为 60,000 个细胞/cm2 时 MCF 7 细胞的每日图像。C) 第 15 次传代时 MCF 7 的细胞形态。D) 一式三份 MCF 7 细胞第 7 至 15 次传代的倍增时间和活力曲线。

第 1 部分：评价培养基直接驯化

按照材料和方法所述进行 A549 细胞的第一次解冻，置于 10% HyClone™ 优级胎牛血清 (FBS)（美国来源）(SH30071.03) 的 HyClone™ Ham F12 培养基（Kaighn 改良培养基 (SH30526.01)）中。我们在解冻时对细胞进行计数，确定结果为 0.25 × 106 个活细胞，解冻后活力为 78%。每天通过显微镜观察追踪细胞解冻后的恢复情况，以评估细胞形态和细胞汇合度（图 15）。如第 1 和 2 天的图像所示，初始恢复速度较为缓慢。因此，我们在第 2 天更换了培养基。在第 5 天细胞汇合度达到 80% 至 90% 时进行了第一次传代。

图 15. 在 HyClone™ 培养基中直接解冻后 1 至 5 天时 A549 的细胞形态和汇合度。

解冻后，每 3 至 4 天进行一次细胞传代，直至第 16 次传代。倍增时间和活力见图 16A。当细胞达到第 6 次传代、第 18 世代时，使用 2.5 MVC/小瓶制备用于研究第二阶段的细胞储备液。代表性的细胞形态图像见图 16B。

图 16. A) 从解冻至第 16 次传代的 A549 的倍增时间和活力。B) 不同传代时 A549 的细胞形态和汇合度。所有图像的比例尺均为 240 μm，图像是使用 10× 物镜拍摄的。

第 2 部分：评价可靠性和可重现性

细胞解冻后，以一式三份培养物的形式保存 A549 细胞，从大约第 19 世代、第 7 次传代开始，直至它们达到第 20 次传代、第 67 世代。在整个 48 天培养期间监测细胞培养物的形态（图 17A-C）。一式三份培养物的活力均高于 98%（图 17D）。从第 8 次传代开始，培养物的平均倍增时间约为 23 h（图 17D）。



图 17. A) A549 细胞解冻后的细胞形态。B) 接种密度为 7000 个细胞/cm2 时 A549 细胞的每日图像。C) 第 19 次传代时 A549 的细胞形态。D) 第 7 至 20 次传代的一式三份 A549 细胞的倍增时间和活力曲线。