用于疫苗生产的细菌荚膜多糖纯化平台方法

包膜细菌性病原体的荚膜多糖 (CPS) 可以在人体内引起有效的免疫反应，普遍用于疫苗生产。本文概述了可以促进基于 CPS 的疫苗生产的现代工具和技术。还提出了一种基于层析的替代纯化方法，该方法可替代传统工艺中的许多乙醇和苯酚提取步骤。使用提议的纯化平台，可以以安全、环保的方式将三个不同种属的 28 种不同 CPS 加工成高纯度和高产量的产品。

简介

疫苗的增长率看起来将大幅提高。2016 年，疫苗市场总价值为 300 亿美元，预计到 2022 年，将达到 450 亿美元 (1)。截至 2016 年，美国公司或在美国进行临床试验的外国公司正在研发的疫苗超过 250 种 (2)。在针对传染性疾病而研发的疫苗中，约有 25 种针对的是细菌引起的疾病。在细菌性疾病的疫苗生产管线中，可以找到针对脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的疫苗。荚膜多糖 (CPS) 是造成这些细菌毒性的主要原因，通常被用于生产针对这些病原体的疫苗。

由于疫苗通常由国家公共卫生部门进行分配，因此开发和生产成本必须较低，这样才能使疫苗实现全球覆盖，尤其是在新兴市场中。传统上，CPS 纯化是通过提取进行的，使用溶剂（例如乙醇和苯酚）去除核酸和蛋白，然后进行乙醇沉淀和离心分离以去除内毒素。对于革兰氏阴性细菌肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，通常包括超速离心步骤以去除脂多糖。这种纯化策略既费时又消耗资源。由于所需溶剂的易燃性高，提取过程通常在防爆室中进行，并且超速离心的成本很高，并非所有制造设施都可以使用此类设备进行制造 (3)。另外，有毒溶剂和其他成分的处理和回收构成安全和环境风险。这样的工艺也很难扩展以满足市场需求。

替换这些传统的纯化策略有助于提高生产率，从而得到更具成本效益和更容易放大的工艺。简单的 CPS 纯化平台方法将加快工艺开发，从而缩短产品上市时间。

针对疫苗生产的 CPS 生产

CPS 由通过糖苷键和磷酸二酯键接合在一起的单糖单元组成，可在革兰氏阳性菌（例如脑膜炎奈瑟球菌）和革兰氏阴性菌（例如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌）周围构成高度多样化的聚合物基团。在根据 CPS 结构分类的 13 种具有临床意义的脑膜炎奈瑟球菌血清型中，血清型 A、C、Y 和 W-135 占全球所有病例的 90%。对于肺炎链球菌，90 种不同血清型中只有少数会引起人类疾病。流感嗜血杆菌可以以未封装和封装形式出现。封装菌株有六种类型（a、b、c、d、e 和 f），其中最常见的是 b 型。对于封装致病菌，细胞外蛋白的隐蔽性阻止了基于蛋白的疫苗的开发。但是，CPS 已显示可在人体内引起有效的免疫反应，因此常用于疫苗生产（表 1）。

CPS 疫苗可以单纯基于纯化的 CPS，即所谓的裸疫苗。更常见的情况是 CPS 与载体抗原共价偶联，形成所谓的联合疫苗。基于 CPS 的疫苗也可以是多价疫苗，其中包括多种菌株特异性成分，可以针对最普遍的病原血清型提供保护。根据全球范围内致病菌株的分布广度，预计在不久的将来，多价结合疫苗将占全球市场的 50% 以上 (5)。

表 1. 疫苗生产中涉及的所选细菌性 CPS 的重复单位 (4)

上游生产

在当今的行业中，通过细菌发酵作用生产 CPS 通常是在不锈钢系统中进行的。由于缺乏能够适应微生物培养物独特要求的一次性生物反应器系统，使用微生物系统的生物制造商对一次性技术的采用一直受到限制。针对哺乳动物培养物而设计的生物反应器不能满足细菌培养要求，例如，有效温度控制所需的高氧转移能力和更高的冷却能力。

随着一次性技术的发展，如今的微生物系统是专门为克服这些限制而设计的，可以满足细菌发酵的要求（图 1）。

图 1. 一次性 Xcellerex XDR-50 MO 和 XDR-500 MO 发酵系统结合使用，可以处理 25 至 500 L 的工作体积。这两个系统的性能可媲美硬管不锈钢发酵系统，同时去掉了费时且昂贵的原位清洁 (CIP) 和在线蒸汽 (SIP) 以及清洁验证程序。一次性技术还可提高操作人员的安全性，因为系统是封闭的，与工艺材料接触的工艺组件在使用后即会丢弃，无需对产品进行开放式处理。

下游纯化

上游工艺决定了下游工艺将需要去除的杂质的类型和浓度。CPS 纯化过程中的典型杂质包括宿主细胞蛋白 (HCP)、宿主细胞 DNA (hcDNA)、色素和其他多糖，例如细胞壁多糖和脂多糖。传统纯化工艺通常包括样品制备步骤以从细胞碎片中分离 CPS，然后在几个选择性沉淀步骤中去除残留的杂质，这些沉淀步骤需要使用乙醇和苯酚等溶剂以及阳离子去污剂。固体与液体的分离通过离心进行。

为了限制使用易燃和有害健康的溶剂，可使用现代层析填料大大减少提取步骤。例如，多模式填料可提供多种作用机制，例如离子交换、疏水作用和氢键结合，通常可以在一个步骤中有效去除 HCP 和核苷酸等杂质（图 2）。

图 2. Capto adhere 多模式阴离子交换填料的 N-苯甲基-N-甲基乙醇胺配基通过多种作用机制与目标分子相互作用，在这些作用机制中，作用最明显的是离子相互作用、氢键结合和疏水作用。

用于去除脂多糖的超速离心步骤可以替换为切向流过滤 (TFF) (6)。在 TFF 中，进料流在与滤膜相切的方向流动。大于孔径的颗粒保持恒定运动，避免形成滤饼，否则会堵塞滤器。TFF 步骤通常使用中空纤维滤器（图 3）。由于具有开放通道结构，中空纤维滤器非常适合微过滤应用，例如回收细菌中表达的蛋白。

图 3. 中空纤维滤器的配置。滤膜形成一组平行的中空纤维。进料流穿过纤维的内腔，从纤维的外部收集渗透物。滤器用纤维长度、内腔直径和纤维数量以及滤器孔径进行表征。

层析和过滤等纯化技术可实现快速轻松的工艺开发。可以使用实验设计 (DoE) 方法来执行实验，以确定实现最高生产率的条件（图 4）。这种方法可通过最少的实验次数来产生最大数量的数据，并满足监管机构对更好了解工艺的要求，这是质量源于设计 (QbD) 方案的基石之一。此外，层析和过滤操作易于放大，与一次性技术和常规技术兼容。

图 4. 工艺开发工作流，包括目标生物分子纯化过程中 (A) 层析和 (B) 过滤条件的初步筛选、验证和进一步优化。

结论

本文概述了有助于解决细菌 CPS 疫苗生产中多种挑战的现代产品和技术。基于一次性技术的发酵系统可节省大量时间，同时提高工艺和操作人员的安全性。涉及易燃或有害健康的溶剂的工艺步骤可以用现代层析填料代替。交叉流过滤为昂贵的超速离心操作提供了一种替代方法。利用工艺开发工作流专用工具和格式，可以大大减少此类活动的时间，从而缩短整体上市时间。将不同的工艺设备集成到一个封闭的系统中进行自动化操作将减少工艺步骤的数量，从而最大程度地减少设施的占用空间。所述纯化平台允许以健康和环保的方式成功纯化多种 CPS 血清型，同时确保高回收率和高纯度。

了解有关我们的疫苗平台的更多信息

参考文献

  1. Carlson, B. For Struggling Pharma Market, Vaccines Offer Path to Revenue.Genetic Engineering Biotechnology News May 23 (2016).
  2. Report: Medicines in Development for Vaccines 2016. PhRMA August 23 (2016).
  3. Noyes, A.R.Modular tools for high throughput process development of polysaccharide vaccines.Doctoral thesis, University College London (2015).
  4. Jones, C. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria.An Acad Bras Cienc 77, 293–324 (2005).
  5. Bae, K., Choi, J., Jang, Y., Ahn, S., Hur, B. Innovative vaccine production technologies: the evolution and value of vaccine production technologies.Arch Pharm Res 32, 465–480 (2009).
  6. Maimoni Gonçalves, V., Takagi, M., Souza Carmo, T., Barbosa Lima, R., Ferreira Albani, S.M., Ventura Pinto, J., Zangirolami, T.C., de Campos Giordano, R., Massako Tanizaki, M., Cabrera-Crespo, J. Simple and efficient method of bacterial polysaccharides purification for vaccines production using hydrolytic enzymes and tangential flow ultrafiltration.Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology 1, 450–457 (2007).