Alligator Bioscience AB 从事癌症治疗的抗体药物研发，专门研究肿瘤靶向免疫疗法的单特异性和双特异性抗体。该公司专注于早期药物开发，包括从早期概念到临床 II 期研究。

本文介绍我们与 Alligator 合作开发癌症免疫疗法双特异性抗体 (bsAb) 高效下游纯化工艺的成果。这项研究的主要发现包括：

  • 将 MabSelect SuRe™ 换成新开发的 MabSelect PrismA™ 填料之后，装填能力提高了 53%（使用装填能力为 70% Qb10 的 MabSelect PrismA™）。
  • 虽然 bsAb 在耐 pH 值和耐盐影响方面的稳定性限制了精纯步骤可用条件的选择范围，但可以通过条件优化在结合/洗脱 (B/E) 和流穿 (FT) 模式下对 Capto™ adhere 进行纯化。
  • 就 bsAb 的稳定性而言，评估的 Capto™ adhere 洗脱条件被认为是适合采用 B/E 的良好条件。
  • 该条件用于精纯步骤 — 但要采用洗脱 FT 模式，而不是 B/E 模式 — 可以显著提高收率（收率 > 90%）并且 HCP 水平和蛋白 A 清除率均达到可接受水平。
  • 改进后的工艺既提高了产品收率又提高了工艺经济性。

简介

近年来，由于可以结合两种抗原，相比单克隆抗体具有独特的作用模式，因而双特异性抗体 (bsAbs) 越来越受到关注。目前，随着新型与改进型抗体生物工艺和重组技术的诞生，临床试验中双特异性抗体结构体的数量激增。截至 2019 年，1 种 bsAb 已获批，57 种 bsAb 正在进行临床试验 (1)。

bsAb 形式多样，都具有两个不同的位点，可以靶向不同的抗原。bsAb 的这种双特异性意味着可以使用一个抗原结合位点与靶细胞结合，而使用另一个抗原结合位点募集其他细胞或分子。

在纯化含 Fc 的 bsAb 时，制造商通常使用基于 Protein A 层析的平台方法来捕获抗体。然后通过后续精纯步骤获得符合终产品质量要求的产品。

本文介绍 bsAb 两步纯化的最新发展。原来的 MabSelect SuRe™ 捕获步骤改为 MabSelect PrismA™ 后提高了工艺的经济性。本研究中使用的 bsAb 是一种抗肿瘤的人 IgG1 对称双特异性抗体，有关该 bsAb 的形式见图 1。

本案例中的双特异性抗体是重组蛋白，与轻链（浅绿色部分所示）的 c 端连接。

图 1. 本研究所用抗体的 bsAb 形式。重组蛋白与轻链（浅绿色部分所示）的 c 端连接，从而形成第二个结合域。抗体的 Fc 部分是没有经过任何进一步改造的完全人源化 IgG1。

目前采用 MabSelect SuRe™ 的纯化工艺

原来的下游 bsAb 纯化工艺采用常规单克隆抗体 (mAb) 常用的平台，不同的是，由于抗体对于 pH 值的敏感性，将传统的低 pH 值病毒灭活步骤改为使用溶剂/去污剂。为了立即提高 MabSelect SuRe™ 洗脱液的 pH 值，将洗脱池中的液体收集到一个用 200 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 6.9) 预处理的容器中。图 2 所示为原来工艺的示意图。

双特异性抗体纯化的下游处理。

图 2. 原来的 bsAb 纯化下游工艺。

评估 MabSelect PrismA™对于 bsAb 的捕获情况

尽管原来使用 MabSelect SuRe™ 的工艺可以获得高收率和高纯度，但为了进一步提高工艺的经济性，我们对最新开发的蛋白 A 填料 MabSelect PrismA™ 进行了评估，考察其是否可以替代前者。

由于实验采用了未经过培养收率优化的早期研究材料，所以澄清后的收获物的滴度较低 (0.8 g/L)。因此，为了减少工艺开发步骤，将停留时间 (RT) 设为 4 分钟，而不是 MabSelect PrismA™ 推荐的 6 分钟。4 分钟 RT 的前沿分析表明，MabSelect SuRe™ 和 MabSelect PrismA™ 填料在 10% 透过率 (Qb10) 时的动态结合载量 (DBC) 分别为 42 g/L 和 64 g/L。

使用 MabSelect PrismA™ 的改进型捕获步骤

使用 Tween™ 20 和磷酸三正丁酯在中性 pH 值下进行病毒灭活。Alligator 提供的含有目标 bsAb 的上清液在室温下用病毒灭活溶液处理 90 分钟。灭活后，我们用 0.5 M NaOH 将 pH 值调至 7.0，并使用 0.22 μm 滤器过滤经过病毒灭活的上清液。

我们测试 MabSelect PrismA™ 的目的是为了研究它是否能提供比 MabSelect SuRe™ 更高的装填能力。

根据透过能力，将装填能力设定为每升 MabSelect PrismA™ 装填 45 g bsAb，相当于 70% 的 Qb10。

在不同的规模下进行测试，首先使用装填 MabSelect PrismA™ 的 Tricorn™ 5/100 层析柱（柱体积 (CV) = 2 mL），得到 bsAb 的收率为 87%。然后，将规模放大到更宽的 Tricorn™ 10/100 层析柱（柱体积 (CV) = 7.4mL），得到的收率为 91%。最后，由于精纯步骤需要更多材料，因此捕获步骤使用更大的 HiScale™ 16/20 层析柱（柱体积 (CV) = 24 mL）进行，得到的收率为 95%。在下游工艺中可以观察到收率通常随层析柱尺寸的增大而增加。

将洗脱的部分收集到 50 mL 试管中。为保持 bsAb 的完整性，该试管预先用 0.3 至 0.4 柱体积 (CV) 的 200 mM 磷酸钠中和缓冲液 (pH 6.9) 处理。

改进后的捕获步骤情况如下：

层析柱：
 Tricorn™ 5/100（柱体积 (CV) = 2 mL）；Tricorn™ 10/100（柱体积 (CV) = 7.4 mL）；HiScale™ 16/20（柱体积 (CV) = 24 mL），装填 MabSelect PrismA™ 填料
样本：
 含有 bsAb 和添加病毒灭活溶液的细胞培养上清液
层析柱装填能力：
 70% Qb10 (45 g/L)
平衡：
 10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，pH 值 7.0，柱体积 (CV) 3
洗涤：
 10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，pH 值 7.0，柱体积 (CV) 7
洗脱：
 100 mM 甘氨酸-HCl，pH 值 3.2，柱体积 (CV) 8（洗脱峰在 90 到 72 mAU 之间）
再平衡：
 10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl，pH 值 7.0，柱体积 (CV) 3
流速：
 4 分钟 RT
在线清洁 (CIP)：
 0.5 M NaOH，3 CV，5 分钟 RT
检测：
 A280 nm
系统：
 ÄKTA pure™ 25

结合/洗脱模式下的 Capto™ adhere 精纯结果分析 (Evaluation)

首先，在原来的下游工艺条件下，我们使用 Capto™ adhere 在 B/E 模式下进行精纯步骤。使用这种方法时，目标分子通过混合模式相互作用与填料偶联的配基结合。随后，pH 值发生变化，使分子从填料中释放出来，然后收集洗脱液。

所用填料为 Capto™ adhere，装填在柱床高度为 20 cm 的 Tricorn™ 5/200 层析柱中。经过 MabSelect PrismA™ 纯化的 bsAb 缓冲液更换为含 10 mM 磷酸钠、80 mM 氯化钠、pH 值 7.4 的溶液。按每毫升填料 27 mg bsAb 进行上样。收集 324 到 297 mAU 之间的洗脱液进行分析。计算得到的收率为 67%，同时 HCP (4 ppm)、浸出蛋白 A (2 ppm) 和聚集体 (0.4%) 的水平均远低于研究开始时设定的水平（图 3）。

在结合/洗脱模式下，使用 Capto adhere 层析填料进行的精纯纯化步骤的双特异性抗体收率为 67%。

图 3. B/E 模式下 Capto™ adhere 精纯步骤的层析图谱。表中所示 bsAb 的收率达 67%。

Capto™ adhere 精纯步骤中的 bsAb 稳定性测试

为了改进 Capto™ adhere 步骤，我们使用极端的缓冲液 pH 值与盐浓度条件评估了 bsAb 的稳定性。我们通过该研究发现，bsAb 可以 pH 值 5 和 7.1 之间、40 至 200 mM NaCl 的条件下保持稳定。使用 96 孔板将纯化后的 bsAb (20 mg/mL) 用符合上述范围的九种不同缓冲条件稀释至 4 mg/mL 的浓度。将样本置于振荡器中孵育 2 小时。

将起始样本的面积与使用凝胶过滤层析法 (SEC) 分析后的样本面积进行对比，以此估算收率。在设定的条件下，我们未观测到聚集体水平或收率受到影响（图 4）。

不同 pH 值和盐浓度的磷酸盐缓冲液中的双特异性抗体聚集体水平和收率对比。

图 4. 使用 pH 值 5.0、5.9 和 7.1 以及盐浓度 40、120 和 200 mM NaCl 的不同缓冲液处理 2 小时后，bsAb 的聚合体水平及收率：(A) 聚合体水平，(B) 收率

精纯步骤：筛选实验

Capto™ adhere 也可用于流穿 (FT) 模式，使杂质与填料结合，并在层析流穿液中收集目标分子。由于装填能力明显高于 B/E 模式，因此 FT 过程的工艺经济性通常更高。

为了提高工艺收率和工艺经济性，我们使用装填有 6 µL Capto™ adhere 的 96 孔 PreDictor 板对潜在 FT 方法进行了评估。此工艺开发的目的是为了确定非结合条件下的最优层析条件，同时获得高收率并且 HCP 水平低于目标值，因为高分子量 (HMW) 物质的含量已经符合规格要求。

测试的平衡缓冲液由 pH 值为 5.0 至 7.1 的 100 mM 磷酸钠和浓度为 40 至 240 mM 的 NaCl 组成。孔用 3 × 200 µL 的平衡缓冲液做平衡处理。上样量设置为每毫升填料上样 157 mg，该上样量也可用于 FT 步骤。然后将孔板置于定轨振荡器上，速度设置为 1100 rpm，孵育 60 分钟。再将孔板的内容物全部转移到 UV 板，以 500 × g 的离心力处理 1 分钟。使用 UV 读取器读取吸光度。

bsAb 的结合载量测试结果如图 5a 中的热图所示，HCP 浓度如图 5B 所示。

PreDictor Capto adhere 96 孔板中双特异性抗体的结合载量和宿主细胞蛋白的收率。

图 5. bsAb 结合载量 (A)，其中蓝色表示结合载量最低（即最适合 FT 应用），红色表示结合载量最高。标记区域所示的条件为 HCP 水平 <100 ppm，即为研究设置的阈值。HCP 的收率百分比如 (B) 所示，其中蓝色表示最佳 HCP 清除率。通过孔板实验为层析柱 FT 模式选择了以下两种条件：pH 值为 5.0 的 40 mM NaCl 和 pH 值为 5.5 的 80 mM NaCl，两者都具有良好的 HCP 清除率和较低的 bsAb 结合载量。

在孔板实验中，我们观察到 pH 值/盐浓度较低的条件下 HCP 清除率更佳。然而，在早期的稳定性筛选中，我们观察到在这些条件下 bsAb 出现了稳定性问题。因此，我们决定将 PreDictor ™ 孔板研究得出的表观最佳条件（pH 值为 5.0 的 40 mM NaCl）与从工艺角度得出的更稳定的条件（pH 为 5.5 的 80 mM NaCl）进行比较。pH 值为 5.5 这一条件与原来工艺中采用的洗脱条件相同，Capto™ adhere 采用 B/E 模式。

流穿模式下 Capto™ adhere 精纯步骤的层析柱研究

在上述两种条件下，将 MabSelect PrismA™捕获步骤捕获的样本在开始和 Capto™ adhere 层析之前的缓冲液换为上样缓冲液。

流穿模式下 Capto adhere 层析填料的双特异性抗体精纯纯化。

图 6. 在 FT 模式下 Capto™ adhere 对 bsAb 进行精纯纯化：(A) 使用 20 mM 醋酸钠、80 mM 氯化钠 (pH 值 5.5)，(B) 使用 100 mM 磷酸钠、40 mM NaCl (pH 值 5.0)。下方横条表示包含清洗液部分在内的收率，上方横条表示不含清洗液部分的收率。

两种 FT 方法的精纯收率均超过 90%。观测发现，与原来的 B/E 工艺（见图 3）相比（收率为 67%），FT 模式的收率显著提高，达到了 94%。

聚集体、HCP 和浸出蛋白 A 分析

分析聚集体采用 Superdex™ 200 Increase 10/300 GL（柱体积 (CV) = 24 mL）凝胶过滤层析 (SEC) 进行分析。

MabSelect PrismA™ 捕获的起始样品中的聚集体含量已经很低，约为 1%。Capto™ adhere 步骤成功地进一步降低了聚集体含量，使其 <1%。（图 7）。相关层析处理中所选部分的聚集体含量在各层析图中以条形图表示，并且在本研究设定的规格范围内。

流穿模式下采用 Capto™ adhere 纯化凝胶过滤层析进行的聚合体分析。

图 7. 使用以下凝胶过滤层析法进行聚集体分析：(A) Capto ™adhere 在 FT 模式下运行，使用 20 mM 醋酸钠、80 mM 氯化钠 (pH 值 5.5)，(B) 使用 100 mM 磷酸钠、40 mM NaCl (pH 值 5.0)。

使用 Cygnus technologies 公司的第三代 CHO HCP ELISA 试剂（适用于 Gyrolab™ 工作站 (Gyros™ Protein Technologies）分析了起始样品中的 HCP 浓度以及B/E洗脱缓冲液步骤、FT 缓冲液步骤中的混合部分以及选定部分洗脱物中的 HCP 浓度（图 8）。

图 8A 清楚地显示了在 pH 值 5.5（11 至 110 ppm）下上样 FT 缓冲液时 HCP 浓度 (ng HCP/mL) 增加。在 pH 值 5.0 的条件下上样时（图 8B），整个上样过程中的 HCP 浓度分布更均匀。在收集的两种汇合液中，HCP 含量大致相同，pH 值 5.5 和 pH 值 5.0 对应的含量分别为 48 和 53 ng HCP/mg bsAb，低于本研究最初设定的规格 100 ng HCP/mg bsAb。此外，汇合液中可能包含洗涤液部分，由于该部分提供的 HCP 水平很低，对蛋白 A 或 HMW 含量没有显著影响。

通过 Gyrolab™ 工作站 (Gyros™ Protein Technologies) 分析的选定部分中双特异性抗体层析纯化的宿主细胞蛋白浓度。

图 8. 使用 Gyrolab™ 工作站 (Gyros™ Protein Technologies) 分析得出的选定部分中的 HCP 浓度，采用的缓冲液为：(A) 20 mM 醋酸钠、80 mM 氯化钠 (pH 值 5.5)，(B) 100 mM 磷酸钠、40 mM 氯化钠 (pH 值 5.0)。

Alligator 的 bsAb 纯化结果汇总于表 1 和表 2。对比操作模式（FT 与 B/E）可发现，收率的提高要以降低 HCP 清除率为代价。由于在两种 FT 条件下获得的结果相似，我们认为该 FT 方法是稳健的。为避免稳定性问题，该步骤应在 pH 值高于 5.0 的条件下操作，即 B/E 模式的洗脱条件也是 FT 模式的首选洗脱条件。

表 1. MabSelect PrismA™ 捕获步骤的结果和 Capto™adhere 精纯步骤的结果

使用 MabSelect PrismA™ 的捕获步骤 装填 70% 的 Qb10 => 每升填料 45 g
收率
 93%
洗脱池：
 HCP 131 ppm
  蛋白 A：11 ppm
  聚集体：0.8%
Capto™ adhere 精纯步骤
 B/E
 FT pH 值 5.5
 FT pH 值 5.0
收率
 67%
 91%
 94%
每毫升填料纯化量
 18 mg
 485 mg
 495 mg
HCP
 4 ppm
 48 ppm
 53 ppm
蛋白 A
 2 ppm
 3 ppm
 3 ppm
聚集体 0.4%
 0.7%
 1.1%

表 2. 总体收率

MabSelect PrismA™ 收率
 93%
 93%
 93%
Capto™ adhere
 B/E
 FT pH 值 5.5
 FT pH 值 5.0
收率
 67%
 91%
 94%
总体收率
 62%
 85%
 87%

结论

本研究得出以下结论：

  • 如果将捕获步骤的 MabSelect SuRe™ 换为 MabSelect PrismA™，在停留时间为 4 分钟的条件下可使上样量增加 53%。该结果可能会随着停留时间的延长而进一步增加，因为流穿曲线显示 MabSelect PrismA™ 的动力学反应比 MabSelect SuRe™ 快。
  • 就 bsAb 的稳定性而言，经过优化的精纯条件被认为适用于 FT 应用。
  • 尽管 FT 精纯模式采用的条件同样可以显著提高收率（收率超过 90%），但 HCP 和蛋白 A 清除率仍在可接受的水平。这为提高工艺的经济性提供了潜力。
  • 比较发现，FT 精纯模式的两种条件的收率和纯度结果非常相似，因此我们有充分的理由相信 FT 模式和条件是非常稳健的。

参考文献

  1. Surs, F.V.et al. A review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges.Pharmacol.Ther. 201: 103–119 (2019).https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2019.04.006