推动药物发现项目以有效地处理众多样本，从而快速筛选潜在的候选对象。当前纯化单克隆抗体 (mAbs) 的方法通常使用液体处理机器人、装有填料的层析柱以及可以并行处理样本的系统。新技术可创造更灵活、快速和高效的高通量方法。在本研究中，阿斯利康评估了快速循环的 Fibro PrismA 层析用于药物发现和早期工艺开发中高通量抗体的纯化。

关于此实验室

通常一周内，阿斯利康的生物表达制品团队就可以以不同规模表达和纯化多达 80 种蛋白，用于早期研究。该团队隶属于“抗体发现与蛋白工程”小组，其生产治疗用蛋白，以支持跨研发部门的多个项目。

大多数蛋白是抗体和基于 Fc 的蛋白，采用柱层析法纯化。传统柱层析法受到流速的限制，从而影响实验室的通量，尤其是运行大量表达不佳的蛋白时。实验室希望优化方法，以尽可能快速、高效地生产高质量的蛋白。

表 1 总结了团队看到的各种样本及其当前设置。

表 1 生物表达团队实验室中的样本、质控和设备概述

*已停产。
SEC = 凝胶过滤层析。

当前高通量筛选面临的挑战

团队在早期研究阶段进行高通量表达和纯化的部分基本原理是研究可能多的候选对象。该团队还进行工艺开发，以找到纯化这些蛋白的最佳条件。

由于早期研究中的表达水平通常很低，因此无法始终为传统高通量工艺开发 (HTPD) 的微型培养提供足够的蛋白。因此，必须培养更大体积的蛋白。由于流速受扩散限制结合效应的限制，使用柱层析法进行纯化的周期很长。在 ÄKTAxpress 系统中采用 1 mL HiTrap 层析柱时，如果流量为 1 mL/min，则纯化周期通常为 55 分钟。

因此，在特定时间段内纯化大量蛋白可能是个挑战，并限制了实验室一周内可以完成的纯化次数。而且还限制了工艺开发中可供参考的参数数量。

鉴于上述因素，该团队增加了层析系统和连接的 HiTrap 层析柱的数量，进而扩大了通量。当前高通量抗体纯化系统由 13 个 ÄKTAxpress 系统组成，最多可运行四个 1 mL HiTrap MabSelect SuRe 或 PrismA 层析柱。这种设置允许实验室在一个工作周内最多使用 52 个 HiTrap 层析柱。

高通量 mAb 纯化 Fibro PrismA 单元评估

纤维层析法基于电纺纤维素纤维基质，具有开孔结构，传质由对流控制。Fibro PrismA 由固定在纤维素基质上的 PrismA 蛋白 A 配基组成。基质和配基组合，可在非常短的停留时间内实现较高的 mAb 结合载量，将填料层析法的运行周期时间从几小时缩短到几分钟。

除上述优点外，稳健的纤维素纤维基质可以承受流速增加导致的高压，从而加快纯化周期，因此 Fibro PrismA 单元深受阿斯利康纯化专家 Jen Spooner 的喜爱。将该纤维基质与实验室已在 HiTrap 层析柱配基中使用的同样稳健的纯化配基相结合，可提高团队抗体捕获的速度和效率。

与层析柱的直接比较

Jen 最初使用 ÄKTAxpress 层析系统对 Fibro PrismA 单元进行评估。使用两个 ÄKTAxpress 系统进行直接比较：将四个 0.4 mL Fibro PrismA 单元放在一台仪器的层析柱位置；将四个 1 mL HiTrap 层析柱放在第二台仪器上。使用相同方案将四个 24 mL 进样上样到每台仪器上，但 HiTrap 层析柱的流速为 1 mL/min，而 Fibro PrismA 单元的流速为 16 mL/min。

蛋白回收率和质量相当，但是 Fibro 单元的速度要快得多：4 个层析柱约 5.5 小时，4 个 0.4 mL Fibro PrismA 单元约 55 分钟，其中包括 6 个柱体积 (CV) 的原位清洁 (CIP) 和重新平衡，以备下次运行。

根据上述结果，Jen 估计，两名工作人员可以在 2.5 天（而非目前的 3.5 天）内纯化 80 个蛋白样本，包括大规模的纯化和精纯步骤。即每人每周可节省 1 天时间。此外，使用 0.4 mL Fibro PrismA 单元代替 1 mL 层析柱后，仅需要 4 个 ÄKTAxpress 系统通常就可以在一周内进行小规模纯化，剩余 9 台仪器可用于其他纯化项目。

利用 ÄKTA avant 系统进行高通量纯化

另一个目标是确定 Fibro PrismA 单元是否也适合工艺开发应用。实验室最近购买了一个 ÄKTA avant 系统，Jen 将其耦合到 Teledyne™ ASX-560 自动进样器上（图 1）。Jen 设计了多项试验，以评估单个 0.4 mL Fibro PrismA 单元的通量和纯化性能，并将结果与在 ÄKTAxpress 上采用 MabSelect PrismA 层析柱进行的实验室标准工作流程的结果相比较。

设置如下：

• ÄKTA avant 和 Teledyne ASX-560 自动进样器
• 一个 Fibro PrismA (0.4 mL) 单元
• 100 个样本，以每批次 10 到 50 个样本运行
• 每个样本之间 CIP 和平衡

将纯化时间和性能与实验室当前设置的纯化时间和性能相比较：在 6 个 ÄKTAxpress 单元和 24 个 HiTrap 1 mL 层析柱上，重复纯化一批 24 个样本（人和小鼠 IgG）。之所以使用 HiTrap MabSelect PrismA 层析柱，是因为其使用与 Fibro 单元相同的配基。

Fibro PrismA 单元每份样本的纯化运行时间低于 10 分钟，其中包括 Fibro 单元的 CIP 和重新平衡时间以及自动进样器管线清洁时间。使用连接至带有自动进样器的 ÄKTA avant 系统的单个 Fibro PrismA 单元时，纯化 24 个样本需要大约 3.5 小时（表 2）。

而采用 6 个 ÄKTAxpress 系统和 24 个层析柱的现有设置时，纯化时间约为 5.5 小时。作为参照，给定同样的纯化运行时间时，如果采用连接到 ÄKTA avant 系统和自动进样器的单个 HiTrap MabSelect PrismA 层析柱，纯化 24 个样本大约需要 33 小时。

表 2 比较带有自动进样器的 ÄKTA avant 系统上采用 Fibro PrismA 与现有和参考设置所需的时间

结果表明，在带自动进样器的 ÄKTA avant 系统上使用 Fibro PrismA 单元进行纯化时，可节省大量时间。此外，标准方法中使用了 6 台仪器和 24 个层析柱，而该方法只使用了 1 台仪器和 1 个单元。

纯化性能和鲁棒性测试

Jen 在一个 0.4 mL Fibro PrismA 单元上运行了 100 份样本，以测试鲁棒性。在每个样本之间，采用 0.1 M 氢氧化钠执行实验室标准的 6 次 CV CIP，然后进行漂洗和重新平衡，以确保样本之间没有残留，并使内毒素保持在较低水平。表 3 总结了该单元上运行的样本以及用于 ÄKTAxpress 比较的 24 个样本的信息。

表 3 在一个 0.4 mL Fibro PrismA 单元上运行的样本

除表 3 中的样本外，还运行了各种抗体和不同人体亚型。然后，为与实验室正常方法作比较，Jen 负责表达的同事制备了两倍于一周小规模表达项目通常所需数量的样本。其中一半样本使用连接到 ÄKTA avant 系统和自动进样器的 Fibro PrismA 单元运行，另一半使用带 1 mL HiTrap MabSelect PrismA 层析柱的 ÄKTAxpress 系统运行。将更多对照抗体上样到 Fibro 单元上，以完成 100 次运行。

13 个重复样本的叠加色谱图表明具有可重现性（图 2）。此外，无论运行多少次，21 个重复样本的色谱图均相似（图 3），表明层析柱性能不受运行之间的 CIP 周期影响。双特异性连续稀释结果显示，可以将浓度纯化至 30 mg/L（图 4），这表明 Fibro PrismA 单元适用于实验室经常处理的低表达培养物。所有种类和亚型的纯化效果均与标准层析柱方法相当。最后，在回收率和纯度方面，在 Fibro PrismA 上纯化的样本与在 1 mL HiTrap MabSelect PrismA 层析柱上纯化的样本相当。

图 2. 13 个对照抗体重复样本的叠加色谱图，上样到安装在带自动进样器的 ÄKTA avant 系统上的单个 0.4 mL Fibro PrismA 单元上。

图 3. 21 个对照抗体重复样本的色谱图，所述样本加载到带自动进样器的 ÄKTA avant 系统上的单个 0.4 mL Fibro PrismA 单元。在 100 个周期内交叉运行。

图 4. 双特异性稀释系列的色谱图，每个样本在带自动进样器的 ÄKTA avant 系统的单个 0.4 mL Fibro PrismA 单元重复运行。

总结和结论

采用 Fibro PrismA 在带有自动进样器的 ÄKTA avant 系统上进行纯化时，每个样本需要约 9 min。Jen 对这个时间很满意，因为每次样本之间都进行了完整的 CIP 和重新平衡，且每次都必须冲洗自动进样器管线。自动进样器可以连续处理 84 个样本且 ÄKTA avant 系统带有 6 个馏分收集器板，Jen 说，“设置后就不必管了。”

为她的实验室带来哪些主要好处？“增加了通量，帮助我们处理更多样本，在低表达蛋白上进行更多工艺开发。” Jen 补充道，“节省了大量时间，每周可为两名员工节省一天时间，从而让我们可以专注更具挑战性的工作。意义非凡。”

未来发展方向

该实验室已购买了自动进样器和 Fibro 单元，并定期使用。未来，Jen 的团队将对大型纯化项目中使用更大的 Fibro PrismA 单元进行评估。

鸣谢

诚挚感谢阿斯利康的 Jen Spooner 及同事为我们提供深入见解，与我们分享数据。

了解有关 Jen 评估的 Fibro 技术的更多信息。