利用现代生物工艺工具和解决方案加速黄病毒疫苗的生产

黄病毒疫苗的开发和生产存在许多挑战,既占用空间又耗费资源。本文概述了现代工具和解决方案,帮助提高黄病毒疫苗生产中的上游和下游操作灵活性和速度。一次性生产生物反应器和层析纯化柱可降低交叉污染的风险,帮助提高操作员的安全性,同时通过消除昂贵且费时的清洁操作来缩短上市时间。一次性技术允许生产方案快速启动和切换,提供了快速适应市场需求所需的灵活性。对于下游工艺,现代层析填料具有高选择性和出色的压力-流速特性,可在生产规模的纯化中实现高生产率。

简介

与所有病毒疫苗一样,黄病毒的复杂性使工艺开发在技术上具有挑战性。此外,疫苗生产成本高,而且难以放大至满足市场需求的规模。例如,在基于鸡胚的疫苗生产中,一个受精母鸡蛋可以生产 100 至 300 剂疫苗。但是,用于生产疫苗的鸡蛋需要由无病原体的特殊鸡群供应,这限制了鸡蛋的可用性,使疫苗生产难以放大。为了满足预防要求,包括常规免疫和应急储备,需要数百万剂疫苗,导致生产既占据空间,又消耗资源。为了更有效地应对市场需求,可采用基于细胞的疫苗生产方案,代替基于鸡胚的疫苗生产方案。然而,基于细胞的疫苗生产传统上是在不锈钢生物反应器中进行,需要大量的清洁和消毒准备时间。替代性的一次性设备最大程度地减少了对昂贵且费时的清洁操作的需求,因为与工艺材料接触过的生产组件在使用后就可丢弃。一次性设备由于不需要对产品进行开放处理,还将交叉污染的风险降到最低,同时帮助提高操作员的安全性。对清洁和清洁验证的需求减少,允许生产方案快速启动和切换。由于所需的洁净室空间更少,一次性技术有助于减少生产设备占用空间以及水电、供暖、通风和空调的成本。

通常用于病毒繁殖的细胞(例如 Vero 细胞)是锚定依赖性细胞,只有在合适的表面上才能增殖。为了满足生物反应器培养中的这一要求,使用了微载体。与传统的摇瓶系统和滚瓶相比,微载体的表面积与体积比更大,因而可在减小占用空间的情况下实现更高的滴度。

然而,上游滴度的增加对下游纯化工艺的载量造成了压力。层析法为沉淀和超速离心等纯化技术提供了一种高选择性和可放大的替代方案。与传统产品相比,现代层析填料压力-流动特性更高,从而提高了生产率。借助这些特点,现代填料可以在更短的时间内生产出更多的产品,比传统产品更适合生产应用场景。

在疫苗生产中,缩短上市时间不仅对制造商有利,对患者也有利。

黄病毒疫苗

黄病毒是复杂的生物分子结构,由一个以上的蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物分子组成。黄病毒的这些特征对疫苗工艺的开发和生产提出了挑战。无论如何,优化的生产过程必须保持较高的回收率和纯度,同时保持病毒颗粒的完整性。此外,精细的病毒颗粒可能对常用的加工条件敏感。

疫苗类型

黄病毒疫苗可以基于活的、减毒或灭活的病毒、重组病毒亚单位、病毒样颗粒 (VLP) 或质粒 DNA 和病毒载体生产。通过对病毒进行修饰,使其能够感染外来宿主,就可以生产出减毒活病毒。在新宿主细胞中生长的修饰后病毒会产生一个与初始种群不同的种群。新种群仍然会在原宿主中正常生长,但毒性会大大降低。与灭活疫苗相反,减毒疫苗含有活的病毒颗粒,但是无害。在灭活疫苗中,基于细胞的病毒颗粒被 β-丙内酯等灭活。

活疫苗、减毒疫苗和灭活疫苗都是全病毒疫苗,利用整个病毒颗粒诱导免疫反应。对于不容易在细胞培养中繁殖的病毒来说,基于病毒亚单位的疫苗可以是一种可行的选择。例如,基于病毒样颗粒 (VLP) 的疫苗可以通过重组表达抗原性病毒蛋白,然后使其自组装成 VLP 来生产 (1)。

疫苗生产

基于鸡胚的疫苗生产技术是生产全系列黄病毒疫苗的常用技术 (2)。但是,基于鸡胚的疫苗生产既浪费空间又消耗资源。另外,基于鸡胚的疫苗生产也有其局限性,需要持续供应无病原体的母鸡蛋。用母鸡蛋生产的疫苗也可能在严重鸡蛋过敏的患者中引起过敏反应。

基于细胞的疫苗生产可以作为一种替代方案,以应对基于鸡胚的疫苗生产中的许多挑战,例如相关的产能限制。但是,通常用于病毒繁殖的贴壁细胞系面临的挑战是,它们只有在提供合适的表面后才能增殖。贴壁细胞的培养以前是在固定培养物中进行的,例如 T 型瓶、多层烧瓶系统或滚瓶。为了提供足够的表面积,需要许多滚瓶或 T 型瓶,这很占空间,而且采样很麻烦。另外,很少或没有针对滚瓶或烧瓶的过程控制。

对于疫苗生产来说,更合适和可重复的替代方法是用微载体进行生物反应器培养。与滚瓶/烧瓶相比,微载体的表面积与体积比更高,因而体积生产率更高,同时还减少了生产设备的占用空间。与滚瓶或烧瓶相比,更高的表面积与体积比也使废物处理量大大减少。此外,生物反应器培养能够自动控制 pH 值和溶解氧,并记录细胞培养数据。对一个生物反应器培养物的采样也比对几个滚瓶或烧瓶系统的采样要省力。另外,当使用微载体时,很容易对部分培养物进行采样,以进行细胞质量控制或鉴定。

许多疫苗生产工艺采用不锈钢生物反应器。然而,这种系统需要大量的鉴定、维护和清洁,这些都是耗时的活动,会降低生产设施的利用率。要提高生产率,可采用一次性生物反应器技术。一次性设备减少了对清洁和清洁验证的需求,允许批次和生产方案之间迅速切换。

此外,不锈钢生产设施的建造通常更加复杂,需要很长的时间。建设采用一次性技术的工厂要比建设传统工厂快得多(图 1)。与不锈钢设备相比,一次性设备灵活性更高。一次性生产线可以更轻易地修改,也能根据市场需求更迅速地调整产量。与不锈钢设备相比,一次性设备每年可生产更多批次的产品,因此利润空间更大 (3)。

图 1. 由 Cytiva 的一次性设备组成的工艺队列,有助于加速黄病毒疫苗的生产。随附的系统适用于各种质量管理体系下受管产品的生物制造。这些系统通过 Cytiva 的 UNICORN 或 Schneider Electric 的 Wonderware ®系统控制软件进行控制。为了确保系统能在监管环境中使用,UNICORN 和 Wonderware 软件经过恰当配置,能够按照 21 CFR Part 11 和 GAMP 5 的要求使用。包括结果和扩展的运行文档在内的所有记录都存储在一个不可更改的数据库中。经专门培训和认证的工程师根据 cGMP 进行现场 IQ/OQ 和 CCP,并为相关人员提供现场培训。

根据 BBC 的研究报告《生物制药界的一次性技术:全球市场》(2013 年),一次性设备的初始资本投入较低是推动采用的一个关键因素 (4)。报告指出,一次性设备的另一个优点在于能够减少交叉污染的风险,因为培养袋在使用后即可丢弃。

在下游病毒纯化方面,传统工艺包括基于沉淀或离心的分离方法。由于从产品中分离杂质的效果不佳,此类技术通常会产生回收率或纯度问题。这些方法也可能难以放大。

层析分离法由于本身很适合放大,因此更适合生产应用场景。现代层析填料由于具有出色的压力/流速特性,能够在短时间内进行大量处理。另外,这些填料具有高选择性和高载量,能够使目标实体获得高纯度和高收率。

解决贴壁培养物中的剪切力敏感性问题

贴壁细胞对剪切力很敏感。波浪式生物反应器系统可对培养物进行轻柔的搅拌,以更好地控制剪切力,同时为培养物提供足够的通气。一次性波浪式生物反应器系统可用于工艺开发、种子培养和小规模生产等各类应用场景。尽管容器的几何形状各有不同,但研究表明,波浪式系统可以有效反映出在搅拌罐生物反应器中进行的工艺 (5)。因此,波浪式生物反应器系统也可用作搅拌罐系统按比例缩小的生物反应器。

一次性搅拌罐生物反应器和发酵系统的原理与传统的不锈钢生物反应器相同。可以在放大过程中使用基于剪切力、叶尖速度、单位体积功率、kLa 和特定的工艺敏感度等措施的传统放大方法。借助搅拌罐系统平台,可以直接进行技术转移,从而最大程度地减少对昂贵且耗时的工艺重新设计的需求(图 2)。

图 2. Xcellerex XDR 生物反应器系统平台专为可放大性和稳健性而设计,可提供从工艺开发到大规模生物制药生产所需的性能和灵活性。从最小的 XDR-10 到最大的 XDR-2000 系统,整个系列的 XDR 生物反应器系统的最大工作容积从 10 L 到 2000 L 不等。

在生物反应器培养中,微载体用于为病毒生产中常用的贴壁细胞提供合适的生长表面(图 3)。基于低密度葡聚糖珠的微载体可实现轻松混合和低剪切力 (6)。粒径和密度经过优化,以支持高细胞生长率和收率。具有生物惰性的多糖基质为搅拌培养提供了稳定但非刚性的组织样底物。基于葡聚糖的微载体是半透明的,便于在显微镜下检查附着的细胞。

图 3 Cytodex Gamma 微载体出厂时经过伽玛灭菌,可用于快速启动培养。此外,Cytodex Gamma 产品在干缩后供应,以节省存储空间并方便运输。为了简化向细胞培养容器的转移,该容器配备了灵活的连接选件。

疫苗生产中使用的许多细胞系都是专性的贴壁细胞,而源自鸭胚胎干细胞的 EB66® 细胞系 (Valneva) 可在无血清悬浮培养物中以较高的细胞密度生长,从而可以轻松、高效地放大(图 4)。EB66 细胞形成松散的聚集结构能促进非分泌型、细胞间传播的病毒的感染 (7)。

图 4 EB66 细胞系病毒的传统生产采用双相方法,需要两种或以上培养基和多种添加剂,而 CDM4Avian 培养基支持更简单的单相方法,需要的添加剂较少。

为了提高细胞密度和病毒滴度,基于微载体的贴壁细胞和悬浮细胞培养都可以使用配备带有细胞截留滤器的生物反应器,在灌流模式下运行 (8, 9)。

提高上游操作的生产率

选择合适的细胞培养基对于提高病毒疫苗生产的收率非常重要。为了做好符合监管要求的准备,建议使用不含动物来源组分的细胞培养基。现代培养基能提供优化的条件,来提高细胞的生长速度和生产率。然而,选择细胞培养基和补料策略时,应考虑所使用的特定细胞克隆的营养需求。营养物质的浓度需要保持在一定范围内,因为浓度过高和过低都会对细胞造成损害。

可利用实验设计 (DoE) 方法进行实验,鉴定培养基中对细胞生长和生产率影响最大的组分组。这种方法可通过最少的实验次数来产生最大数量的数据,并满足监管机构对更好了解工艺的要求,这是质量源于设计 (QbD) 方案的基石之一。

实现下游纯化的高效率

实验设计 (DoE) 方法还可以用于确定影响下游工艺中纯度和产量的参数。层析填料选定后,就可以确定在最大产品回收率下最大程度去除 hcDNA 和 HCP 的条件。

阳离子交换层析填料和阴离子交换层析填料都常用于病毒疫苗的纯化工艺,来降低杂质含量。配基对特定病毒如腺相关病毒表现出亲和力的亲和层析填料也有用例。对于要求更高的分离,可以使用具有多种作用机制(离子交换、疏水作用和氢键)的多模式层析填料。近年来,市场已开发出新型的多模式层析填料。在这些填料中,磁珠引入了双层的设计,将无活性外层的分子排阻特性与配基活化核心的吸附层析填料结合在一起(图 5)。小分子进入核心,在那里被捕获;而病毒和其他大型实体则被排阻在外,可以在流穿模式下被收集。

图 5 Capto Core 700Capto Core 400 填料示意图,显示其带有惰性多孔外壳和含配基核心的磁珠。蛋白质和杂质(绿色、黄色和紫色)渗透到核心,而目标病毒(红色)和较大的生物分子(对于 Capto Core 700,> Mr 700000;对于 Capto Core 400,> Mr 400000)则被排阻在填料之外,在流穿模式下通过。

现代填料专为要求高通量和工艺经济性的大规模层析工艺而设计。他们的基质具有出色的机械稳定性和优化的孔径,可在高流速条件下进行有效捕获。机械稳定性提高,也提高了柱床高度的灵活性和处理高粘度补料的能力。这些填料的化学稳定性确保了较长的寿命,即使采用了苛刻的清洁程序也是如此。由于具有高体积通量和高产量的特点,现代填料为快速高效地加工大量蛋白质提供了强大的解决方案。在严格要求高通量的情况下,可以使用膜层析法。层析膜具有适合病毒纯化的高孔隙率,同时允许使用高流速。

精细目标过滤

错流过滤 (CFF),也称切向流过滤 (TFF),是一种广泛用于疫苗生产的技术。与死端过滤 (NFF) 不同的是,补料在可渗透的膜表面上进行再循环。在 CFF 中,分子量小于膜截留值的液体和化合物可以通过膜,而较大的分子或微粒则被截留并浓缩。对于诸如黄病毒等精细目标,通常在 CFF 步骤中采用中空纤维滤器。由于具有开放通道结构,与盒式过滤器相比,中空纤维滤器通常对目标产品的损害更小(图 6)。对于以低滴度表达的病毒颗粒(因此需要将其浓缩至 200 至 500 倍,然后再进行进一步处理),可以将一次性管道组件用于设计低工作体积的回路,以实现高浓缩系数 (11)。

图 6 Cytiva 的 750 C 中空纤维滤器,孔径为 750000 标称截留分子量 (NMWC),专用于病毒纯化工作流,可有效地去除鸡胚病毒生产中的卵白蛋白和尿囊液中的其他蛋白质,以及细胞中因生产出现的宿主细胞衍生杂质。在浓缩和洗滤工艺中,与内腔直径同为 0.5 mm 但孔径为 500000 NMWC 的 500 C 中空纤维滤器相比,750 C 滤器由于结构更开放,在宿主细胞蛋白 (HCP) 去除率和病毒收率相近的情况下,能将宿主细胞 DNA (hcDNA) 去除率提高 1.5-2 个数量级 (10)。

借助多功能分析技术获得洞察

病毒的复杂性也对过程分析提出了挑战。理想情况下,疫苗表征的分析方法应与工艺开发同时开发,以帮助获得监管部门的批准,推动生产。

疫苗设计取决于与宿主免疫系统的结构性和功能性相互作用。基于表面等离振子共振 (SPR) 的无标记分子相互作用分析已广泛用于疫苗开发和生产,如设计和表征、免疫反应研究、疫苗定量以及生产和质量控制期间的分析(图 7)。

图 7 疫苗的开发和制造由 Biacore SPR 系统提供从基础研究到生产和质量控制的全程支持。可从分析中获得详细信息,例如结合动力学、特异性、免疫反应、表位图和浓度。

比如在寨卡病毒的例子中,相互作用数据可用于深入了解中和抗体与病毒表位的结合 (12)。使用 SPR,还可从分析中获得结合动力学、特异性、免疫反应、表位图和浓度方面的详细信息 (13)。

结论

技术挑战可能会主导疫苗生产。本文概述了可以帮助解决黄病毒疫苗生产中许多挑战的现代产品和服务。基于一次性技术的生物反应器系统帮助节省了大量时间,同时提高了基于细胞的疫苗生产的过程和操作员的安全性。微载体提供了生物反应器培养物中贴壁细胞高体积生产率所需的细胞表面。使用现代层析填料,可以在给定的时间内纯化更多的产品。基于 SPR 技术的无标记分子相互作用分析可用于最终产品的可靠定量和表征。易于监管的系统控制软件确保设备使用符合 cGMP 要求。

现代疫苗生产平台帮助减少工艺时间和成本,从而帮助加快黄病毒疫苗的生产。

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参考文献

  1. 应用说明:使用 Capto Core 700 和 Capto Q ImpRes 纯化人乳头瘤病毒样颗粒。Cytiva, 29098301, Edition AB (2014).
  2. 应用说明:使用 Capto Core 700 在鸡胚流感疫苗生产中去除卵白蛋白。Cytiva, 29103762, Edition AA (2014).
  3. 白皮书:使用一次性与不锈钢发酵设备的工艺经济性和产能。Cytiva, 29143348, Edition AB (2015).
  4. 报告:生物制药界的一次性技术:全球市场 (ISBN: 0-89336-291-3)。BCC Research, Wellesley, MA 02481 (2013).
  5. 应用说明:使用一次性搅拌罐生物反应器系统和波浪式生物反应器系统,在补料分批工艺中高效、高滴度地生产单克隆抗体。Cytiva, 29119376, Edition AA (2014).
  6. 应用说明:比较 Cytodex 和 Cytodex Gamma 微载体,验证 ReadyToProcess WAVE 25 生物反应器系统中流感病毒的产生。Cytiva, 29209415, Edition AA (2016).
  7. 应用说明:使用化学成分确定的培养基在悬浮适应的禽类细胞中生产病毒。Cytiva, KA968041017AN (2017).
  8. Nikolay, A., Hermann, K., Genzel, Y., Reichl, U. Evaluation of producer cell lines in yellow fever virus production in up to 1 L bioreactor scale.Poster at Vaccine Technology VI, June 12–17 (2016).
  9. Nikolay, A., Castilho, L., Tanuri, A., Reichl, U, Genzel, Y. Propagation of Brazilian Zika virus strains in static, microcarrier-based and suspension cultures using BHK and Vero cells.Poster at Vaccine Technology VI, June 12–17 (2016)
  10. 应用说明:使用 750 C 中空纤维滤器浓缩和洗滤细胞衍生的活流感病毒。Cytiva, 29092826, Edition AA (2014).
  11. 应用说明:小体积、高回收率、高效浓度低滴度牛 IgG。Cytiva, 29228378, Edition AA (2016).
  12. Dai, L., Song, J., Lu, X., Deng, Y-Q, Musyoki, A.M., Cheng, H., Zhang, Y., Yuan, Y., Song, H., Haywood, J., Xiao, H., Yan, J., Shi, Y., Qin, C-F., Qi, J., Gao, G.F.Structures of the Zika virus envelope protein and its complex with a flavivirus broadly protective antibody.Cell Host & Microbe19, 696–704 (2016).
  13. 白皮书:Biacore 系统在疫苗开发和生产中的应用。Cytiva, 28987028, Edition AB (2016).