BufferPro 是 ÄKTA™ avant 自带的缓冲液在线配置功能，通过四元阀的设计，将复杂的缓冲液配置功能进行简化，只要选择对应的配方，配置Q1-Q4四种母液，即可根据实验要求进行缓冲液配置，简化实验流程。

如何设置缓冲液浓度，包括以下类型：

1. 缓冲液的浓度
   1. 在方法的 “ 方法设置 ” 阶段，选择 “ 使用 BufferPro”选项。
      

      

      图1. 方法设置“BufferPro”选择模块

   2. 选择配方并输入 pH 和缓冲液浓度。
      注意：对于宽 pH 范围的多组分缓冲液，盐浓度是固定的。
   3. 保存方法。
备注：此时设置好的浓度是固定的，在层析过程中始终保持一致，无法更改。
2. NaCl的目标浓度
   可通过B泵拉梯度的方式，实现NaCl目标浓度的改变。具体可以参考此链接。

1. 默认保存位置：方法运行的结果，系统默认保存在“用户名”对应的 Home 文件夹中。例如，以用户名 Default 登陆 UNICORN™，在该UNICORN™软件控制的任意一台仪器上，以方法运行模式运行的结果，都默认保存在 DefaultHome 文件夹中，如图1所示。
   

   

   图 1 方法运行结果的默认保存位置

2. 另存为：方法运行的结果，用户可以另存为的方式，自主选择或新建要保存的文件夹并自定义文件名。设置方法：在 System Control 界面，点击 File → Open，在弹出的 Method Navigator 窗格中选择要运行的方法，双击，弹出 Start Protocol… 窗格，在 Result 区块的 Directory 填框处点击 Browse 按钮自主设置保存的文件夹和文件名，如图2所示。
   

   

   图 2 方法运行结果的另存为保存方式

Method queue 是一系列即将运行的方法，这些方法可以是同一个方法也可以是完全不同的方法，可设置每个方法运行的时间及先后顺序，方法依照时间顺序依次运行。在单个系统上，Method queue 中可插入清洗实验，用于不同实验间系统清洗，允许利用单系统全自动化处理不同样品。实验者也可以利用最多3个系统运行这些方法，届时首个系统分离的产品可作为下个系统的样品，进而利用另一系统进行样品的下一步分离，允许多步骤自动化处理同一样品。

Scouting 用于基于同一方法的自动重复运行，不同次运行间可能会对1个或多个变量进行改变，可用于筛选相对简单的变量组合对实验结果的影响。

UNICORN™ 软件中可设置两种洗脱方式： Isocratic elution（等度洗脱）或 Gradient/Step elution (梯度洗脱)。

其中 Isocratic elution 只使用一种缓冲液洗脱，通常用于凝胶过滤层析。可设置收集体积为 1.5 CV，使用 0% B 液，使用 Fraction collector 进行峰收集。

图1. 等度梯度洗脱

Gradient elution 适用于各种吸附性层析的洗脱过程。可以设置 Linear 或者 Step 两种梯度形式，其中 Linear 为线性梯度，即在一定的 Length 内从目前梯度达到 Target %B, Step 为步级梯度，指在命令开始时直接达到 Target %B, 之后运行相应的 Length。

下图使用线性梯度方式洗脱，输入开始及结束时缓冲液 B 的比例以及在多少个柱床体积（CV）内B 逐渐达到设置目标比例。

通过点击 Add Segment 可以设置更复杂的多步洗脱。

如下图中在 Type 一栏中选择 Step，输入 Target % B 为 20 以及 Length 为5 CV 进行第一步阶段洗脱（Step elution）。

点击 Add Segment 添加第二步洗脱，在 Type 一栏中选择 Linear ，输入 Target %B 为 100 以及 Length 5.00 CV。

图2. 线性梯度洗脱

最终的洗脱方式如下图所示。

图3. 洗脱方式示意图

备注：如果使用模板，梯度到达 Target 之后会有一个延迟洗脱体积以保证完全洗脱。详细原因可以点击此链接。

执行 Prime Sample inlet with 命令时，样品入口管、泵和进样阀之前的流路会被样品充满，从而能够精确控制进样体积。为了确保管路被完全充满，建议使用仪器随附的管道，且须以系统默认体积Prime。这部分液体将从废液口排出，不进层析柱。

注意：Prime过程中会损失少量样品。

Watch 命令能够监测特定的检测信号，当信号检测值高于或低于指定阈值、斜率高于或者低于指定阈值，或者信号检测数值稳定在一定范围内并保持住设定时间后，就进行设定的单一操作命令或Block 操作命令集合。Watch 命令需要在 Method Editor 窗口中的 Text 文本编辑框编辑使用，具体使用步骤为：

1. Text 编程框中在需要运行 Watch 监测信号来决定运行特定命令的地方插入 Watch 命令，Watch 命令在 Instruction Box 的 Watch 栏目中。
   

   

   图 1 插入Watch命令

2. Watch 命令参数包括：（1）Signal 设置需要监测的信号类型，常见的有：UV三个波长UV1-3，电导，pH值，压力，是否空气报警，流速。（2）信号值的阈值 Value 和关系 Test：Greater than 为信号检测数值高于阈值，Less than 为信号检测数值低于阈值，Slope greater than 为信号斜率高于阈值，Slope less than 为信号斜率低于阈值，Less than or valley 为信号检测数值先出现波峰然后降低并低于阈值或者拐头向上形成了波谷，Peak max 为信号检测数值出现波峰不再创新高然后下降到了最大峰数值的一定比例，Stable signal 为信号保持稳定在一个范围并维持设定的分钟时长。
   

   

   图 2 Watch命令参数

3. Action 设置的是一旦信号 Signal 满足特定的阈值条件后该执行什么样的操作，操作分为三种：
   1. 下拉菜单中列出的单一命令，如 Pause 暂停，如 Next breakpoint 跳到下一个，将此刻到下一个 breakpoint 期间的命令跳过不执行，如 Hold 保持当前的状态不变不继续执行下一个命令，如 End Method 直接结束程序等，选择完毕后点击 Insert 则插入了这个 Watch 命令。
   2. 下拉菜单中列出的已有 Block 命令集合，然后点击 Insert 则插入了这个 Watch 命令后，一旦信号源满足阈值条件，则执行已有 Block 中的命令集合。
   3. 新建 Block，可以直接在 Action 选项中直接输入新的 Block 名称，则点击 Insert 后，接着在产生的 Watch 的 Block 中插入想要的命令集合。一旦信号源满足阈值条件，则执行该Block中的命令集合。
      例如下图中的 Watch 命令是当UV1超过100 mAU后，则执行自定义名称为 What You Want To Do 的 Block 命令集合，该集合中含有两个命令，一个是设置流速为5 ml/min，另一个为收集样品至15 ml离心管，每管收15 ml。

      

      图 3 Watch命令

在编辑方法时若不使用预装柱，可选择 Column type → Any 选项即可。若想直接选取自行装填的柱子则需要在 Column Handling 中预先添加层析柱的信息，随后即可在编辑方法时直接选取该层析柱。添加层析柱信息的详细步骤，请点击此链接。

选择 Step 时，系统梯度立即变为当前设置条件。而采用 Step with fill 时，系统首先会按照设置的 %B 进行 System wash，泵洗废液从进样阀 W1 废液口排出，结束后再按照当前设置梯度条件运行，从而使得系统中B液的比例更加精准。

如图1，按照顺序执行命令 File → New Method Queue … 打开命令界面。

图 1 打开方法队列

图2显示弹出的 Method Queue 界面，在 Method 处按顺序选择执行的方法，在 Start Condition 处选择运行方法的时间，点击save，保存方法队列。

图 2设置方法队列

运行该方法队列，在 System Control 界面打开即可。

图 1 设置筛选变量

如图1所示，点击工具栏上对应图标打开 Scouting 设置界面，在 Scouting Variables 对话框中选定需要改变的参数，点击 OK。

如图2所示，点击 Insert Run 添加实验，输入各变量的参数，点击 OK ，系统即会按照设定的参数进行多次串联运行。

图 2 Scouting中多个实验排列

运行该 Scouting 方法，在 System Control 界面打开即可。

ÄKTA™ avant设备软件的 BufferPro 自动配液功能模块中已录入了26种缓冲液配方，此外ÄKTA™操作者可以在此基础上添加自定义缓冲液配方，操作如下：

1. 在 Method Editor 中，在Tools下拉菜单中选择 BufferPro Recipes…。
   

   

   图 1 BufferPro Recipes

2. 在弹出的对话框中，点击New 之后，在Q1、Q2、Q4下拉菜单中选择酸、碱，盐的种类然后输入母液浓度，软件即可计算出此配方的可以配置出的pH缓冲范围和盐的浓度范围，如果满足优化要求，即刻点击Save As 命名（例 New Recipe）并保存此配方，其中选择 Global 则 UNICORN™ 所有用户都可以使用，Personal 为仅限此登录的用户使用。
   

   

   图 2 新建BufferPro配方

3. BufferPro 缓冲液自动配置功能必须在运行方法时才能使用，Method Editor 中，在 Method Settings 选择新建的配方，输入需要的pH数值和缓冲溶质的浓度 Conc，即可在程序运行中使用此新建的配方。
   

   

   图 3 Method中使用BufferPro

首先确定仪器配备的是多波长U9-M还是单波长U9-L，U9-L无法更换波长，可以监测280 nm的光吸收值。U9-M可以更换波长，波长可选范围是190-700 nm。具体操作：

如果是编辑好的方法，路径如下：Method Editor → Method Settings → Monitor settings-输入想要检测的波长；

图1. 方法编辑中设置监测波长

需要借助 Method Queue 来实现。具体操作如下：

1. 选中以下icon创建方法队列 New Method Queue

   

   
   如图1，首先需要在 System 设置运行该方法队列的ÄKTA设备。可以在 Method 设置一个方法，或者多个方法。从第二个方法开始，可以设置与第一个方法的间隔时间。设置完成后保存 Save/Save As…，点击 Close。

   

   图1 创建方法队列

2. 运行 Method Queue 设置方法开始运行的时间
   在 System Control 界面左侧的 Method Navigator 处选中该方法队列，双击，即可根据需要选择该方法队列的运行开始时间，如图2。需要注意，在运行方法队列前，最好根据方法检查收集管的数量，避免出现因收集管数量不够方法报错暂停的情况。

   

   图2 指定方法运行时间

1. Empty loop with 意为清空样品环体积。
2. 如果上样体积小于样品环体积，Empty loop with 输入实际的上样体积即可；如果需要将loop环里的样品全部上样至层析柱，Empty loop with 输入样品环体积的3-4倍（具体操作可以参考该链接）。
3. 清空样品环的体积取决于所用层析柱的载量。

鉴于流路中存在管线与阀门的延迟体积，为确保在达到设定的梯度值时流路中所有成分被各检测器完全检测并被收集，因而有 Gradient delay。这段体积由系统默认设置，不同型号设备默认设置的体积有所不同。

Fill the system with the selected buffer 是指以选择的缓冲液进行 System Wash 操作。如在换用了其它比例的B缓冲液情况下，用新的缓冲液对系统进行高流速的冲洗操作（从缓冲液入口到进样阀 waste 口）。此时系统使用默认体积的缓冲液以默认的较高流速进行冲洗，以保证系统中的（流入层析柱）液体能快速切换为您希望的缓冲液。