作者：Caroline Serino-Silva et al.
发表日期：2018年3月
发表期刊：PLOS ONE
研究背景
蛇毒中含有Phospholipases A2 (磷脂酶PLA2)，它能够作用于被咬生物体细胞膜的磷脂结构，催化甘油磷脂sn-2位上的酰键发生水解反应，产生溶血磷脂和脂肪酸，造成被蛇咬伤的部位组织炎症，水肿，肌肉坏死，神经毒性、出血毒性、肌肉毒性、心脏毒性等症状。因为蛇的血清中具有抑制物能够抑制磷脂酶的活性，因此蛇能够自然抵抗这个酶的作用，将蛇毒从蛇血清中纯化出来偶联到CNBr填料上面，将蛇的血清流穿过这个填料，从中垂钓和纯化出该磷脂酶的结合物蛋白γBjPLI，大约25 kDa大小的蛋白质，后进一步证实在体外实验能够抑制PLA2酶，动物实验证实γBjPLI能够降低肌肉坏死以及水肿的现象。将纯化后的γBjPLI在体外验证PLA2酶的抑制作用发现，加入20微克的γBjPLI即可在体外抑制PLA2酶的活性，抑制率可以高达40%。动物实验证明，当动物注射了PLA2和γBjPLI时要比单独注射PLA2酶相比，水肿现象明显减弱，同时体内磷酸激酶的活性也具有明显降低，说明组织坏死的水平较低。
实验方法
称取C. d. terrificus蛇毒干粉 449 mg，溶解于2.5 mL的50 mM Tris，0.1 M NaCl，pH 7.4中，4500 × g离心15 min再经0.45微米滤膜过滤，然后用Sephacryl S200 HR进行分子筛纯化。纯化后的蛇毒20 mg与 2 g的CNBr-activated Sepharose按照说明书的步骤完成偶联。
从10条B. jararaca 蛇中尾静脉穿刺取血，放置4度过夜，1200 × g 离心15 min获得上清即蛇血清，7 mL的蛇血清换液至25 mM Tris buffer, pH 7.5中，然后利用DEAE填料 (1.6 × 2.5 cm) 纯化，上样后先用25 mM Tris buffer，pH 7.5，100 mM NaCl洗杂，然后100-500 mM NaCl线性梯度洗脱。将线性梯度洗脱下来的样品置换到PBS溶液中。
将偶联和蛇毒的亲和填料用PBS平衡，将DEAE洗脱的样品上样，再PBS洗杂后，用1 M glycine，pH 2洗脱2 mL，然后用1 M Tris，pH 8.8中和。
产品信息
| 类别 | 货号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 预装柱 | 17515401 | HiTrap DEAE FF | 5 × 5 mL |
| 填料 | 17043001 | CNBr activated Sepharose 4B | 10 g |
| 空柱 | 28988937 | Column XK 16/20 | 16/20 |
