作者：Cynthia et al.
发表日期：2017年1月
发表期刊：Journal of Chromatography A.

研究背景

DNA 适配体是短的单链寡核苷酸，能够折叠成三维构象，从而能够对给定的靶标进行精确的分子识别。它们对靶分子拥有极高的选择性和极低的平衡解离常数(Kd)。此外，适配体可以选择识别从非常小的化合物到蛋白质等大分子的高度多样性的分子。它们的选择过程无需要在特定缓冲液中进行分子识别的情况下完成，核酸适配体对蛋白酶具有抗性，并且可以引入化学修饰以进一步增强其对生物环境中存在的核酸酶的抗性。此外，固相上的化学固定可以定向以保持适配体的三维结构的完整性，从而实现最高的对接效率。一旦DNA 适配体接枝到填料上，其可以耐受严格的化学试剂再生，承受高 pH 值、高浓度盐和高温条件。此外，高灵敏度的 Q-PCR 技术可以方便地用于检测纯化的治疗蛋白产品中可能释放的适配体痕迹。

在这篇文章中研究者描述了 DNA 适配体介导的亲和色谱工艺，从不同来源血浆中纯化得到高价值的血浆蛋白。

实验方法

用 SPR 法测定适体的选择性亲和力

用 Biacore T100进行实验，数据用 Biacore 评估软件进行评估。将适配体 Mapt2.2 CS、 MaptH1.1 CSO 和 Nonapta5.1进样到链霉亲和素芯片中直至饱和。将凝血因子 VII (FVII) ，血液补体因子 H (FH)和凝血因子 IX (FIX)在运行缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5的10mM CaCl₂，FVII 的50mM Tris-HCl，pH 7.5的10mM MgCl₂和50mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl₂1mM MgCl₂，pH 7.4的 FIX)中稀释，然后在60秒内分别以200nM和1μM浓度对比注射。等待一段时间后，观察解离曲线。

适配体与填料的偶联及测定结合容量

将所需量的5′-氨基修饰的适配体在醋酸钠中稀释。然后其与琼脂糖混合。然后加入pH 8.5、100mM Tris-HCl 缓冲液的除去所有未反应的位点。用含有500mM NaCl，pH4.0和100mM Tris-HCl 缓冲液，pH8.5的100mM 乙酸钠交替洗涤来冲洗亲和吸附剂。为了确定接枝适体的数量，将洗涤上清液与一系列适体稀释液(已知浓度)进行比较。

流速为0.5 mL/min、将0.5 mL 制备得到的亲和填料装在柱上并用含有10mM CaCl₂，pH 7.5的50mM Tris-HCl 缓冲液平衡。然后载入一定量超过容量的纯化的亲和蛋白。然后用含有10mM EDTA 的50mM Tris-HCl 缓冲液解吸 F-VII。收集各组分，用280nm OD 测定洗脱蛋白的含量。

纯化纯化FVII：1 ml 经5′氨基修饰 Mapt2.2CS 的亲和填料装入XK16 ，层析过程流速为 0.5 mL/min ；平衡后上样，其一是将 200 μg 血浆 FVII 用平衡缓冲液稀释后注入色谱柱;其二是 FVII加入未经预处理的牛奶中（4.2 mL，900 μg FVII， 0.21 mg/mL）进行上样；吸附的蛋白质会被含有 10 mM EDTA（pH 7.5）的 50 mM Tris-HCl 缓冲液洗脱。洗脱后对柱子再生和消毒。

纯化FIX： 1ml经5′氨基修饰的 Nonapta5.1 的凝胶装柱 ，层析过程流速为 0.5 mL/min ；pH 7.4，50 mM Tris-HCl 缓冲液平衡后上样；2.6 mg 血浆 FIX稀释到150 mM NaCl、0.5 mM CaCl₂ 和 1 mM MgCl₂，上样体积16.3 mL；2 M NaCl 缓冲液洗涤后用 200 mM EDTA洗脱 ；最后进行柱子再生和消毒。

纯化FH： 1ml 、5.2mg 经5′ 氨基，修饰 MaptH CSO 的亲和填料装入XK16 ，层析过程流速为 0.5 mL/min ；50 mM NaCl和10 mM MgCl₂的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）平衡后上样， 5 mg 血浆来源的 FH 或 45 mL 含有重组 FH 的细胞培养上清液稀释后进样；然后使用含 100 mM EDTA的pH 8 、50 mM Tris-HCl 缓冲液洗脱。

产品信息

Reference
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28179082/