作者：Ter-Ovanesyan D et al.
发表日期：2023年5月
发表期刊：Elife

研究背景

细胞外囊泡是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构的统称，这些囊泡的直径可以从30到9um不等。细胞外囊泡主要可以分为3个亚群：（1）凋亡小体ApoBDs，囊泡尺寸较大(1 ~ 5 μm)，结构组成多变；（2）微囊泡MVs，直径为150 nm~1 μm；（3）外泌体exosomes，直径范围为30到150 nm，也是目前研究相对火热的领域。

所有细胞都会将细胞外囊泡 (EV) 释放到血浆等生物液中。 由于EVs的含量远低于血浆中的游离蛋白和脂蛋白，从丰度较高的游离蛋白和类似大小的脂蛋白中分离 EVs在技术上仍然具有挑战性。

实验方法

1. 评估不同琼脂糖含量分子筛的分离效果
   选用单步骤的尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）填料Sepharose CL-2B、Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B的纯化效率对比，三种填料的琼脂糖含量分别为2%，4%和6%； 使用 Simoa 测量每个收集组分中的 CD9、CD63、CD81、白蛋白和 ApoB-100以评估纯化效率。 结果发现，在琼脂糖含量最小的SEC填料 Sepharose CL-2B 中，EVs / ApoB-100 的比率较高，纯度最好，但收率最低。
2. 三种层析方案纯化EVs 的效率对比
   方案一：SEC层析方案，研究者选用10 mL柱体积的Sepharose CL-6B层析柱进行实验；
   方案二： SEC+CIEX方案，因为EVs通常带负电荷，故选择利用阳离子交换填料用来分离EVs和脂蛋白，研究者装填了顶层10 ml Sepharose CL-6B，底层2 ml 阳离子交换填料的双模式层析柱；
   方案三：对于SEC+CIEX+MMC方案，研究者认为Capto Core 700这种多模式层析MMC填料在底层使用时，这种树脂会“捕获”在 SEC 过程中与 EVs 共同分离的游离蛋白质。研究者同样在顶层装填了10 ml Sepharose CL-6B填料，在底层以2：1的比例混合CIEX填料和MMC填料后进行装填。

装填好层析柱后，取用1mL血浆的血浆样品，在PBS洗液通过层析柱后上样。样品完全进入层析柱后，流出组分收集0.5 mL。然后加入PBS，体积等于收集的一个馏分分数（0.5 mL）或一组四个馏分分数（2mL）。对于EVs组分的评估实验，【方案一】组分收集7-10个馏分，【方案二】和【方案三】收集至9-12个馏分；
使用 Simoa 实验，将SEC、DMC 和 TMC 柱对 EVs、脂蛋白和游离蛋白的相对水平进行定量；
结果表明，【方案二】和【方案三】的 EVs产量低于【方案一】，但 EVs/ApoB-100 比率显着较高。 尽管与 SEC 相比，【方案二】柱的 EVs / ApoB-100 的比率较高，但 EVs /白蛋白的比率无显著改善；
另一方面，与 SEC 柱相比，【方案三】柱的 EVs / ApoB-100的比率 ，以及 EV / 白蛋白的比率较高，取得了最好的纯化效率，具有小样本量深度蛋白质组学分析的优势。

产品信息

Reference
Dmitry Ter-Ovanesyan, Tal Gilboa, Bogdan Budnik, Adele Nikitina, Sara Whiteman, Roey Lazarovits, Wendy Trieu, David Kalish, George M Church, David R Walt (2023) Improved isolation of extracellular vesicles by removal of both free proteins and lipoproteins eLife 12:e86394