细胞和基因疗法市场的快速增长为先进治疗领域创造了令人振奋的机会。我们可以利用 RNA 和 DNA 病毒的独特功能来传递功能基因以替代缺陷基因，从而实现和发展大量细胞和基因疗法。传递这些疗法的媒介是病毒载体，其中腺相关病毒 (AAV) 最为大家所熟知，因为此类病毒已被证明对人体是安全的，同时还具有较低的免疫原性。
通常通过用含有目的基因的质粒 DNA 转染来生产 AAV 和慢病毒载体。随着产品进入临床阶段，对可放大性质粒 DNA 生产的需求越来越大，必须首先在 GMP 设施或高质量质粒 DNA 生产区域中进行生产和纯化。这给制造商带来了压力，制造商需创造必要的载量和资源来满足对高质量质粒 DNA 不断增长的需求。CDMO Cobra Biologics 认识到需要解决其自身的质粒 DNA 载量限制问题，这不仅要提高物理载量，并且要通过重新检查当前使用的纯化工艺来满足对病毒载体生产快速增长的需求。这些公司与 Cytiva 合作，开发了用于纯化质粒 DNA 的下一代层析填料，以降低开发成本并通过增加质粒批量和提高设施通量来提高生产能力。该填料基于 Cobra 的需求开发，但已作为产品提供给其他用户订购。
供应商和生物制造商之间的关系通常被视为交易关系；然而，通过这种合作，Cobra 和 Cytiva 能够将其专业知识和经验相结合，并开发了针对此制造难题的解决方案。Cobra 和 Cytiva 的成功表明，当供应商和制造商共同努力促进创新并进入药物开发的新时代时，可以实现互惠互利。
改变势在必行
Cytiva 在 20 年前开始对质粒 DNA 纯化产生兴趣，由此开发了层析填料 PlasmidSelect Xtra。PlasmidSelect Xtra 是一种亲硫芳香族吸附层析填料，其选择性可将质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环形式与开放环形式分离。但是，PlasmidSelect Xtra 对于质粒 DNA 的结合载量需要大量层析柱才能捕获可用量。由于高背压，PlasmidSelect Xtra 同时限制了流速，这反过来又限制了可以装填的层析柱尺寸和可以处理的批大小。
Cobra 知道这些限制会影响其工艺可放大性，从而限制其满足客户对后期和在售产品质粒 DNA 日益增长的需求。
图 1. 质粒 DNA 通常用于生产病毒载体。
另外，由于许多质粒仅生产一批或两批用于临床试验，并且仅利用了填料寿命的一小部分，因此有效填料成本可能很高。业已确定，提高层析柱的结合载量和通量对于优化产品利用率和成本以及提高总制造能力至关重要。另外还需要一种容易再生的填料，用于后期临床试验和在售临床材料。
Cobra 和 Cytiva 意识到必须开发一种解决方案，该解决方案不仅要具有可放大性，而且还必须保持超螺旋和开环的分辨率，这是满足 90% 以上超螺旋质粒 DNA 的客户规格所必需的，同时还需要提高载量和维持可接受的产品成本。开发这种解决方案的好处对两家公司都是宝贵的，因为基因疗法市场的机会正在迅速增长。但是，要利用这些好处，就需要投资和开发可以使这些疗法商业化的产品。
用于质粒 DNA 纯化的现代填料
在与 Cobra 合作的项目开始时，Cytiva 的 Capto 填料平台已经通过其高结合载量和流速证明了比其原有 Sepharose 填料具有更高生产率。从具体的 Capto 基架可以提高生产率的角度，Cytiva 与 Cobra 讨论了之前尝试过的方法，深入了解了哪些方法可能更有效。基于此，定制填料设计团队开发了多个原型，其中评估了不同的现有基质和现有配基的不同密度。所考虑的参数是具有不同磁珠尺寸和孔径的 Capto 基质以提高通量性能，以及可变配基密度以优化选择性和载量。
这些原型填料中的一部分被送至 Cobra 进行质粒 DNA 工艺评估。在 Cobra 使用 ÄKTA avant 150 系统进行测试，使用预装填 HiScreen 层析柱，允许在实验之间无需操作员输入的情况下自动筛选多种填料。根据产量、超螺旋质粒 DNA 纯度、残留 RNA 和残留宿主细胞蛋白 (HCP) 来评估原型填料。与目前的 PlasmidSelect Xtra 填料相比，所评估的最佳原型填料能够使结合载量和流速提高达 50%，并且具有类似 PlasmidSelect Xtra 的纯化性能。
使用定制层析柱装填服务将原型填料装填到 HiScreen 格式的层析柱中，从而可以进行更快速的研究以评估性能。选择合适的填料后，Cytiva 提供了大量最有前景的原型填料，因此 Cobra 可以进行放大活动并确定合适的层析柱载量。利用更高的填料装载量进行了更深入的实验，反映了大规模实际工艺条件。
根据所选的填料原型，Cytiva 开发并商业化了名为 Capto PlasmidSelect 的新填料。该填料主要基于 Cobra 的需求开发，但可供其他客户订购。与现有的质粒 DNA 纯化工艺相比，新填料使 Cobra 工艺中的总填料体积减少了 50%。此外，与使用原有填料的现有工艺相比，总缓冲液体积和工艺时间减少了达 50%。
| 假设条件 | ||
|---|---|---|
| 标准 | PlasmidSelect Xtra | Capto PlasmidSelect |
| 质粒数量 | 70 g | |
| 装载量 | 650 L | |
| 最大填料载量 | 2 mg mL -1 | 3 mg mL -1* |
| 最大柱床高度 | 15 cm | |
| 装载/洗涤流速 | 100 cm h -1 | 150 cm h -1 |
| 洗脱流速 | 50 cm h -1 | 80 cm h -1 |
表格 1 新型质粒纯化填料对大规模质粒 DNA 纯化的影响；
* 对于某些质粒，可能会进一步增加。
有了这种新型的改良填料，Cobra 现在有机会解决生产能力问题。目前计划在 Cobra 的新制造套件中将其应用到质粒 DNA 制造工艺中，使质粒 DNA 生物反应器从 50 升扩大到 500 升，规模扩大 10 倍。
解决新疗法的制造限制
随着当代产品组合变得更加多样化，生物制造商和供应商之间的开放式沟通至关重要，以便通过新疗法消除行业限制，例如 Cobra 需要更好的填料来高效生产质粒 DNA。制造业供应的之所以存在瓶颈，可能是由于开发新技术的需求产生与实际投资之间的滞后所致。在制造中及早发现可能的解决方案将有助于缩短早期临床试验的时间表，并提高制造的商业化率。寻找有能力的合作伙伴并利用其技能可以促进该类型的讨论，并在开发有效的解决方案时抢占先机。
然而，合作关系破裂通常是因为制定了远大目标但缺乏实现目标的手段，其原因不仅因为缺少技术，还因为不能投入资源。在促成 Cytiva 和 Cobra 之间无缝协作的众多因素中，包括必要的资源投入以及两个团队对现实目标的共同承诺。每个团队都愿意透明化地分享自己所掌握的知识：Cobra 在临床早期新型质粒 DNA 方面的丰富经验以及 Cytiva 在生物制造技术和解决方案方面的专业知识。为了生产出所需药物挽救更多患者的生命，行业需要解决新兴疗法（例如基因疗法）开发的许多关键挑战。
Janice Charlesworth：Cobra Biologics 下游工艺主管
Tony Hitchcock：Cobra Biologics 技术总监
Hazel Tharia：Cobra Biologics 技术协调负责人
Henrik Ihre：Cytiva CDM 总监
Åsa Hagner McWhirter：Cytiva 资深科学家