摘要

T 细胞免疫疗法的治疗潜力令人振奋。尽管嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞在临床上已经取得成功，但若要将这些产品做为常规替代治疗方法，仍存在一些挑战。这些挑战包括成本高昂的生产工艺，它需要漫长而复杂的开放式工作流程，且手动操作需求高，同时造成产品产生差异性。

本文详细介绍稳健的 CAR T 细胞生产工作流程。该流程符合 CAR T 细胞商业化生产中现行药品生产质量管理规范 (cGMP) 的要求。这种半自动化封闭式 CAR T 工艺可获得 1 × 10¹⁰ 个扩增的 T 细胞。在 8 天的生产过程中，增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 的转导效率大于 80%。

简介

仅 2019 年，就预计美国将诊断出 170 万新癌症病例，将有约 60 万美国人死于癌症 (1)。尽管药物联合化疗仍是标准疗法，但是越来越多的成年人和儿童接受常规治疗后无法取得良好的效果，这一情况激发了探索“下一代”癌症治疗方法的积极性。

与常规化疗不同，目前正在开发阶段的新方法，基于对免疫肿瘤学的更深入理解。在这些方法中，过继性 T 细胞治疗产品因其治疗潜力而备受关注。诺华公司 (Kymriah™) 和 Gilead/Kite (Yescarta™) (2) 的自体 CAR T 细胞疗法已通过审批，突出说明了使这些治疗方法适用于患者的前景和面临的挑战。

目前，业界越来越需要端到端的工作流解决方案来支持 CAR T 细胞疗法的工业生产的横向和纵向规模扩展。为了应对这些挑战，我们研究了各个 CAR T 单元的操作，以发展商业化的试剂和模块化的设备，来推动工艺的闭合和自动化，从而提高工作流程效率和产品一致性。CAR T 的工作流程如图 1 所示。

图 1. 半自动封闭式 CAR T 细胞生产工艺的工作流程。流程开始和结束时的细胞材料用灰色背景突出显示。单元操作以白色背景显示。

我们评估了市售 T 细胞富集和活化试剂、可选用的封闭式小型培养容器、增强转导的替代解决方案以及工艺步骤的特定时间。这样做的目的是开发一种模块化平台流程，确保该流程既稳健又灵活，可满足 CAR T 开发人员的各种需求。

有关材料和方法的详细信息见文末。

结果和讨论

解冻和洗涤方法的比较

可以使用开放式手动方法解冻和洗涤白细胞采集物中的细胞。但是，这些方法不符合不断发展的 GMP 要求，并且可能会带来与操作员操作差异和污染相关的风险。作为替代方案，可以使用一种封闭式自动化方法来解冻和洗涤细胞。这种方法可以降低手动操作需求和产品差异性。

使用 Smart-Max AS-310 配套的 Thaw-Large Volume 程序软件*‡结合 Sepax 2 配套的 SmartWash 程序软件†进行冷冻白细胞采集物的解冻和洗涤，细胞回收率和活力结果可与手动方法媲美（双样本 t 检验 p ≥ 0.05，n = 3）（图 2A）。自动化方法也能取得与此相当的 T 细胞回收率、纯度和活力（双样本 t 检验 p ≥ 0.05，n = 3）（图 2B）。

*对于上游解冻，我们使用了与 Smart-Max 仪器配套的 Thaw-Large Volume 程序软件。也可以选择使用 VIA Thaw 解冻仪进行上游和下游加工。
†本研究使用 Sepax 2 细胞分离设备。但是，建议在生产时使用效果与此等效的 Sepax C-Pro 设备。
‡即将推出。关于产品的发布，不作任何保证（Cytiva 保留更改任何产品发布计划和时间的权利）。

图 2. 手动和自动解冻和洗涤后的回收率和活力。(A) 手动或自动解冻和洗涤后立即测得的存活外周血单核细胞 (PBMC) 的回收率和活力；(B) EasySep Release 人 CD3 正选后富集 T 细胞的回收率、纯度和活力。条形表示同组三份生物样本的平均值，彩色圆点表示各供体值。

T 细胞富集方法的比较

有几种市售方法可用于富集 T 细胞群体。两种常见的系统是 CD3⁺ 阳选和 CD14⁺/CD19⁺ 阴选。为了确定富集 T 细胞的最佳方案，我们评估了两种 CD3⁺ 阳选法和一种 CD14⁺/CD19⁺ 阴选法。

如预期，CD14⁺ 和 CD19⁺ 细胞群阴选法获得的 T 细胞纯度明显低于任何一种 CD3⁺ 阳选法（单因素方差分析，p < 0.001，n = 3）（图 3B）。使用 EasySep™ Release 人 CD3 正选试剂盒进行 T 细胞富集的回收率明显高于使用 QuadroMACS™ 系统进行选择的结果（单因素方差分析，p = 0.01，n = 3）（图 3B）。但是，在富集的 T 细胞群之间，活力和 5 天扩增动力学在统计学上均无显著差异（单因素方差分析，p ≥ 0.05，n = 3）（图 3C）。

                              (A)

                              (B)

                              (C)

图 3. 富集方法的比较。(A) EasySep CD3⁺ 阳选之前和之后的门控细胞的 FlowJo™ 表示；(B) EasySep CD3⁺阳选、QuadroMACS CD3⁺ 阳选或 QuadroMACS CD14⁺/CD19⁺ 耗竭后的 T 细胞回收率、纯度和活力；(C) 相对于各供体 EasySep CD3⁺ 富集 T 细胞生长的第 5 天活力和累积扩增倍数。条形表示同组三份生物样本的平均值，彩色圆点表示各供体值。

T 细胞转导方法的比较

为了优化转导，需要对在 T 细胞初始活化后进行转导的时间点。尽量在较早的进行转导，以尽可能缩短流程持续时间。目前正在使用的 T 细胞转导方法有数种。然而，其中很多种方法依赖于培养皿或培养瓶中的开放式手动处理，这些工艺不太可能符合 GMP 要求。

作为替代方案，我们用慢病毒 (LV)-eGFP 转导 T 细胞，在 Sepax C-Pro 仪器上测试了自动的功能封闭式 SpinOculation C-Pro 程序软件。

图 4 显示了最佳转导时间研究结果。通过 CD3⁺ 阳选法富集的 T 细胞在第 0 天转导（单因素方差分析，p = 0.000，n = 3）和第 1 天转导（单因素方差分析，p< 0.001，n = 3）的转导效率高于阴选法。但是，活化后 2 天转导的细胞未见差异（单因素方差分析，p ≥ 0.05，n = 3）。总体观察结果表明，在活化 1 天后，CD3⁺ 选择的细胞的转导效率最高（单因素方差分析，p < 0.02，n = 3）。

图 4. 最佳转导日期研究结果。活化后不同天数转导的 72 小时后 eGFP 阳性 T 细胞的百分比。条形表示同组三份生物样本的平均值，彩色圆点表示各供体值。

如这些方法所述，分多组将现用的各种手动转导方法（方瓶、摇瓶和 RetroNectin™）与 Sepax C-Pro 仪器上的 SpinOculation C-Pro 程序软件进行比较。通过 Sepax C-Pro 配套的 SpinOculation C-Pro 实现的自动封闭式转导方法在培养结束时得到的细胞活力（图 5A）和转导效率（图 5B）与手动方法相当。

图 5. 转导方法的比较。(A) 培养活化阶段后使用不同转导方法的细胞活力（转导后 3 天或 4 天）；(B) 培养结束时 eGFP 阳性 T 细胞百分比（转导后 7 天或 8 天）。条形表示两个生物供体的同组三份技术样本的平均值。

T 细胞扩增方法的比较

有几种开放式方法可用于在细胞进入生物反应器之前进行小规模的 T 细胞培养，其中最常见的方法是在方瓶中进行培养。还可采用封闭式方法（例如透气袋和 G-Rex™），但在我们之前的评估中，这些方法无法达到在方瓶中观察到的生长动力学结果（数据未公布）。我们将 Erlenmeyer 摇瓶作为封闭式培养替代容器进行研究，它可以匹配接种在方瓶中的 T 细胞的扩增倍数。

在 T 细胞活力或扩增方面未发现统计学上显著的差异（双样本 t 检验，p ≥ 0.05，n = 4）（图 6A）。图 6B 显示了培养结束时的细胞表型比较。在 T 细胞纯度或 CD4⁺ 和 CD8 ⁺ 亚群方面未发现统计学上的显著差异（双样本 t 检验，p ≥ 0.05，n = 4）。

图 6. 小规模培养方法的比较。(A) 相对于各供体的方瓶中 T 细胞生长的第 5 天活力和累积扩增倍数；(B) 在培养结束时使用流式细胞仪测定的 T 细胞及其亚群 CD4⁺ 和 CD8⁺ 的表型分析。条形表示四组两份生物样本的平均值，彩色圆点表示单独的值。

大规模转导的 T 细胞生产

使用 Smart-Max AS-310 配套的 Thaw-Large Volume 程序软件和 Sepax 2 配套的 SmartWash 程序软件对白细胞采集物进行自动解冻和洗涤，同时使用 EasySep Release 人 CD3 正选择试剂盒、Sepax C-Pro 仪器配套的 SpinOculation C-Pro 程序软件进行 T 细胞富集，并在摇瓶和 Xuri 细胞扩增系统 W25 中进行小规模活化和扩增（图 7）。

图 7. 工艺工作流程。用于从冷冻白细胞分离单元制备临床相关剂量的 CAR T 细胞的步骤和系统图。大多数步骤在功能上都是封闭和自动化的，并且过程符合 GMP 指导原则。在 Sepax 2 上测试白细胞采集物的洗涤，其等效产品 Sepax C-Pro 已经上市出售。SF = 摇瓶。

通过三次大规模生产运行，我们使用上述设置从解冻和洗涤步骤中获得了超过 75% 的细胞回收率，并且活力超过 90%（图 8A）。使用 EasySep 系统通过磁分离获得富集的 T 细胞群，将 T 细胞初始输入群的纯度从 53% 提高到 62%，并且无论细胞的起始群如何，输出的纯度均提高到 95% 以上（图 8B）。

图 8. 富集后 T 细胞的纯度和回收率。(A) 使用 Sepax 2 及其配套的 SmartWash 程序软件后的活 PBMC 回收率和活力；(B) EasySep Release 人 CD3 正选后富集 T 细胞的回收率、纯度和活力。条形表示同组三份生物样本的平均值，彩色圆点表示各供体值。

分离后，将细胞活化、转导并在摇瓶中扩增 4 天，然后转移到 Xuri 细胞扩增系统 W25 中。4 天后，超过 68% 的 T 细胞群完成转导（图 9A）。T 细胞在 Xuri 细胞扩增系统 W25 中从起始细胞群扩增了 78 倍以上（图 9B）。在整个培养过程中，转导率保持在 84% 以上（图 9B），第 8 天可获得超过1×10¹⁰个以转导的T细胞T 细胞超过 1 × 10¹⁰（图 9C）。

图 9. 培养生长和转导效率。(A) T 细胞的累积生长与活力。曲线表示扩增情况，三角形表示 CAR T 过程中的活力。(B) 在摇瓶中活化后以及在 Xuri 细胞扩增系统 W25 中培养后的转导 GFP⁺ T 细胞的百分比。条形表示同组三份生物样本的平均值，彩色圆点表示各个供体的值；(C) 供体 1、2、3 的第 8 天累积 GFP⁺ T 细胞。

培养后，冷冻保存前，使用 Sefia S-2000 细胞处理仪及其配套的 FlexCell 程序软件收获扩增的转导 T 细胞。经过浓缩、洗涤和冷冻制剂后，总活细胞回收率超过 95%，而活力未降低（图 10A）。细胞冻存袋在 VIA Freeze Quad 中冷冻保存，然后转移到液氮储存器中。

图 10B 显示了手动洗涤、离心和缓冲液交换后，使用 VIA Thaw CB1000 解冻后的细胞的活力和回收率，用于评估冷冻保存后的细胞（作为最终注入患者体内的产品的替代品）。如图所示，细胞回收率超过 70%，活力超过 97%。结果还表明，在冷冻保存过程中，转导率保持在 80% 以上。

图 10.T 细胞的回收率和活力。(A) 使用 Sefia S-2000 仪器及其配套的 FlexCell 程序软件收获后，来自供体 1 和 2 的培养的 T 细胞的回收率和活力；(B) 使用 Sefia S-2000 仪器及其配套的 FlexCell 程序软件冷冻制备后，冷冻保存的转导 T 细胞解冻后的回收率和活力。

结论

本研究中使用的工作流程适用于工业化自体 CAR T 细胞生产，因为它结合了几种功能上封闭的自动化单元操作。这种大规模转导的 T 细胞生产提供了临床相关剂量（每个供体 1 × 10¹⁰ 个细胞）且转导效率高（> 80% eGFP⁺）。从表型上看，最终产物表现出活化 T 细胞群的特征。

未来的工作重点可以放在微调各个步骤以降低成本并同时保持稳健、可扩展的工艺流程。例如，可以通过减少培养基更换量以及优化摇摆速度和角度，来进一步改善生物工艺参数（例如搅拌和摇摆速度等）以及灌流策略。

总体而言，本文介绍的方法与 CAR T 生产的工业工作流程相容。本文介绍了半自动 T 细胞扩增和关键单元操作闭合的可行性。具体而言，摇瓶内的小规模扩增证明了其有可能替代在透气袋或密闭瓶中静态培养的传统方法。

致谢

所有工作均与 CCRM 合作进行，资金由 FedDev Ontario 和 Cytiva 在加拿大安大略省多伦多市的前沿细胞治疗技术中心 (CATCT) 提供。研究结果的报告和解释由作者负责。

参考文献

1.Report: Cancer Facts and Figures, American Cancer Society (2019). Accessed 22 May 2019.

2.Approved Cellular and Gene Therapy Products, United States Food and Drug Administration. Accessed 22 May 2019.

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