要创建一个完整的层析模型,则需要考虑对吸附球珠内的组分吸附。在本文中,我们将讨论用于离子交换、疏水相互作用和混合模式层析的吸附模型。
在流行模型中,将吸附物质的浓度描述为流动相中物质浓度和吸附剂浓度的函数。实际上,当今使用的大多数模型都将吸附视为一种反应,其中一摩尔蛋白质 (P) 和一摩尔配基 (L) 与一摩尔蛋白配基复合物 (PL) 发生反应。大蛋白质经常发生多点结合,因此所需的配基数量按 n 倍的化学计量系数增加。
在下一步中,将质量作用定律应用于该化学方程式。在该方程式中,反应物的摩尔浓度做底数,其对应化学计量系数做幂指数,可得到平衡常数 K。由此得到平衡等温线方程,该数学模型可以直接运用于描述流体动力学的方程系统中。
通常,吸附和解吸过程都非常快。许多模型中假设该过程可以瞬时达到平衡。一般来说,等温线方程表示吸附物质浓度随时间的变化率。
Langmuir 模型
长期以来,Langmuir 等温线模型是研究最广泛的模型。该模型仅考虑单点结合。它是等度模型,这意味着流动相在运行期间不会改变其组成。缓冲液浓度的变化不会对吸附产生任何影响。由于制备层析中缺乏实际相关性,该模型的基本形式主要仅用于学术研究。
图 1. 单点蛋白质结合示意图。
固定相中蛋白质浓度与流动相中蛋白质浓度之间典型的 Langmuir 型关系如图 2 所示。在流动相中蛋白质浓度较低时,该比率呈线性并用斜率 k 表示。在负载浓度较高时,固定相中的浓度达到最高结合载量 qmax。q 和 c 之间的比率形成了表征等温线曲线。
图 2. Langmuir 模型固定相和流动相中蛋白质浓度的关系。
胶体颗粒吸附 (CPA) 模型—离子交换层析
CPA 离子交换层析模型使用 GoSilico™ 层析建模软件开发和实现,该模型使用蛋白质的胶体性质描述蛋白质吸附。与下面讨论的吸附模型相比,CPA 模型不是基于简单的化学计量方程,而是基于离子交换柱内静电相互作用的基本描述,并与离子强度和 pH 值成函数关系(如图 3 所示)。
由于流动相中蛋白质相互作用增加,该模型考虑了吸附剂表面的位阻和吸附蛋白质之间的静电相互作用。因此,吸附剂的饱和容量受蛋白质可及表面积的物理限制。吸附蛋白质覆盖的吸附剂表面积越大,流动相中的蛋白质撞击吸附剂表面的概率就越低。
图 3. 离子交换柱内蛋白质吸附的 CPA 模型,与离子强度和 pH 值成函数关系。
空间质量作用 (SMA) 模型—离子交换层析
SMA 等温线模型是使用多点结合、抗衡离子影响和置换的离子交换层析 (IEC) 的常用模型。该等温线模型基于离子在带相反电荷表面上的化学计量交换。假设吸附蛋白质为游离的 v 摩尔盐离子,并且盐离子位于参与结合的配基上。反应方程式变为:
当缓冲液成分固定时,SMA 模型与 Langmuir 模型具有非常相似的形状,如图 4 所示。随着流动相浓度的增加,达到饱和状态。与 Langmuir 模型相反,该模型的饱和浓度不是用蛋白质的 qmax 表示,而是总离子交换容量的函数。
图 4. 离子交换柱内蛋白质吸附的 SMA 模型。
模型建立后,就可以研究原材料可变性的影响。模型中包含的进一步影响是位阻和排斥。当接近饱和时,溶液中的蛋白质无法再靠近某些结合位点。这是因为它们被空间屏蔽或由于更强的排斥力而无法使用,如图 5 所示。
图 5. 蛋白质间排斥作用引起的蛋白质吸附位阻效应示意图。
疏水相互作用模型
疏水层析 (HIC) 的分离原理基于蛋白质表面上的疏水区与固定相的疏水配基之间的可逆相互作用。通过基于 Mollerup 热力学框架进行建模,使得对于 HIC 的根本认识有了进一步发展。它利用所谓的不对称活动系数根据质量作用定律推导出了简单的方程。从而实现了对盐控层析工艺的模拟。
GoSilico™ 层析建模软件实现的 HIC 等温线模型考虑了疏水表面上有序水分子和块状有序水分子之间的平衡。通过确定离子水合数与盐浓度的函数关系,解决了在 HIC 建模中加入盐效应的难题,如图 6 所示。
图 6. 基于疏水相互作用模型的蛋白质吸附。
混合模式层析 (MMC)
目前 MMC 等温线模型以上述两种吸附模式(即离子交换和疏水相互作用)同时发生作为基本假设条件。因此反应方程式相应地进行扩展,以便通过带电和疏水结合两种位点进行结合。所得方程是空间质量作用 (SMA) 模型和采用不对称活性系数的 Mollerup 的 HIC 模型的组合。
GoSilico™ 层析建模软件中采用类似的 SMA 与 HIC 模型组合取得了同样好的效果,但使用的蛋白质特异性参数更少。在工业层析应用中,很少需要对两种相互作用模式进行理解和建模。通常使用混合模式吸附剂替代过去采用的纯离子交换或疏水相互作用工艺。如果该工艺运行方式相似,则完全可以假设一种模式占主导地位并根据 MMC 进行 IEC 或 HIC 建模。
图 7. 基于混合模式层析模型的蛋白质吸附
其他层析模式
过往成功建模的其他层析模式有反相层析 (RPC) 和亲和层析 (AC)。蛋白 A 层析比较受关注,尤其是 mAb 工艺。但是创建的模型迅速偏离了化学方程式和质量作用定律所设定的路径。