作者：马萨诸塞大学 Anna Ucher
重组腺相关病毒载体 (rAAV)（例如 rAAV5 血清型）作为基因疗法递送系统已经过广泛评估。在本文中，我们将展示 HyClone™ peak expression 细胞培养基如何促进重组蛋白的表达。我们在 Xcellerex™ XDR-10 和 XDR-200 生物反应器中采用 HyClone™ peak expression 培养基对该工艺的可放大性进行了研究，并与摇瓶培养工艺的性能进行比较。结果显示，HyClone™ peak expression 培养基可以提高 HEK293.2 sus细胞的生长、活率和 rAAV 产量。
简介
rAAV 载体已作为基因疗法递送系统经临床前和临床研究评估，适用于纠正囊性纤维化和 B 型血友病等遗传性疾病 (1)。目前已开发出多代 rAAV，安全性和产量更高，并可以产生更有效的疗法 (2)。但是，AAV5 血清型在临床研究中很常见，可以为 rAAV 的工艺开发提供合适的模型。
人胚胎肾 (HEK 293.2) 悬浮 (sus) 细胞系可作为包装细胞系支持 rAAV5 的生产（使用三重质粒转染）。然而，细胞的最佳性能取决于多个因素，例如特定细胞克隆的生长和产率、培养基的组成、以及培养条件，例如搅拌、通气和温度。在设计细胞培养基时，了解这些因素对于代谢过程的影响至关重要。了解细胞系的代谢活动、营养需求和废物产生，有助于确保使用正确的营养成分组合和数量，尽可能减少导致细胞毒性的废物产生。
支持瞬时转染和细胞生长
HyClone™ peak expression是一种无蛋白、无动物源性成分的培养基，可促进重组蛋白的生成。开发该培养基的目的是使细胞生长保持高活细胞密度 (VCD)，支持表达多种重组蛋白的瞬时转染以及提高 HEK 293.2 sus 细胞在悬浮培养工艺中的产率。
我们使用 HyClone™ peak expression 培养基在摇瓶中培养 HEK 293.2 sus 细胞，并对细胞的生长、活力和 rAAV 产率进行了评估。之后使用Xcellerex™ XDR-10 和 XDR-200 生物反应器对工艺的可放大性进行了研究，并与摇瓶培养工艺的性能进行比较。
采用培养基对细胞进行驯化
使用 HyClone™ peak expression 培养基通过对 HEK 293.2 sus 细胞 (ATCC) 进行直接驯化（种子细胞培养在BalanCD™ HEK293 培养基 (Fujifilm Irvine Scientific)，接种细胞密度为 5.0 × 105个细胞/mL）。每 3 至 4 天在室温条件下通过添加新鲜培养基的方式进行细胞传代。连续传代培养，直至细胞的群体倍增时间 (PDT)达到24 到 30 小时之间，并且细胞活率高于90%。
摇瓶培养
将 HEK293.2 sus 细胞接种于装有 30 到 50 mL HyClone™ peak expression 培养基的 125 mL 摇瓶中，接种密度为 0.4 ×106 个细胞/mL。在振荡培养箱中以 140 rpm、37°C 和 5% CO2 的条件进行培养。当细胞计数和活率下降到一定程度时终止培养。细胞培养按三次重复进行。
病毒增殖
通过三质粒转染系统对细胞进行转染。该系统由一个递送腺病毒基因的 pHelper 质粒、一个 Rep/Cap（复制和衣壳蛋白）质粒和另一个在末端反向重复序列 (ITR) 之间包含有目的基因（GOI，在本研究中是指绿色荧光蛋白 [GFP]）的质粒组成，这三个质粒对于将目的基因包装到 AAV 衣壳中必不可少。helper: Rep/Cap: GOI 质粒的比例为 2.0:1.5:1.0。在密度为 2 × 106个细胞/mL 的培养物中，以 2:1（PEI 比 DNA）的比例使用线性化聚乙烯亚胺 (PEI, Polysciences Inc.) 诱导转染。收获时间 (TOH) 为转染后第 4 天，通过微滴式数字 PCR (ddPCR) 检测绿色荧光蛋白 (GFP) 转基因盒，从而确定病毒滴度。
病毒滴度
采用 100 μL 的 10× 裂解缓冲液（5% Tween™ 20、10 mM 氯化镁、200 mM Tris，pH 8.0）和 20 U/mL Turbonuclease 酶在摇床中对大约 900 μL 培养物进行处理（37 ℃，持续 4 小时）。将等分试样以 15000 × g 离心 10 分钟，并对粗裂解上清液进行 ddPCR 分析。
生物反应器培养
以 0.5 × 106 个细胞/mL 的密度将 HEK 293.2 sus 细胞接种于装有HyClone™ peak expression 培养基的一次性 Xcellerex™ XDR-10 L 细胞培养袋中，生物反应器的最终批体积为 9 L。使用表 1 中列出的培养参数，在 XDR-10 生物反应器中进行细胞培养。将细胞从摇瓶移到 WAVE™ 生物反应器（Xuri™ 细胞扩增系统 W25）中，再移到 XDR-200 生物反应器中，以此进行扩增。
表 1.工艺放大研究的生物反应器条件
| 参数 | XDR-10 生物反应器运行 | XDR-200 生物反应器运行 |
| 培养基 | HyClone™ peak expression 培养基 | HyClone™ peak expression 培养基 |
| 工作容量 | 9 L | 180 L |
| 叶轮转速 | 120 rpm（上扬方向） | 158 rpm（上扬方向） |
| 温度 | 37°C | 37°C |
| pH 值设定点 | 7.3（通过 CO2 和碱进行控制） | 7.3（通过 CO2 和碱进行控制） |
| 溶解氧 (DO) 设定值 | 40%（通过富氧空气进行控制） | 40%（通过富氧空气进行控制） |
| O2 流速 | 通过比例积分微分 (PID) 进行控制 | 通过 PID 进行控制 |
| CO2 流速 | 通过 PID 进行控制 | 通过 PID 进行控制 |
结果
采用 HyClone™ peak expression 培养基对细胞进行驯化
将保存于 BalanCD™ HEK293 培养基 (Fujifilm Irvine Scientific) 中的 HEK 293 细胞在 HyClone™ peak expression 培养基中直接解冻。3 至 4 日后，细胞分裂至密度为 0.4 至 0.5 ×106 VC/mL，并维持几次传代培养。对 VCD 和 PDT 进行监测（图 1）。
使用第 5 代传代细胞建立细胞库。将细胞冻存于加入二甲亚砜 (DMSO) 的 HyClone™ peak expression 培养基中，浓缩至细胞密度为 20 × 106 VC/mL，并将 1 mL 等分试样转移至冻存管中。将细胞库冻存于 CoolCell™ 冻存盒 (Cool Lab, LLC) 中，在 -80°C 下过夜，然后将其转移至液氮储罐中。
待多个细胞库冻存管解冻后，我们对细胞的 VCD 和群体倍增时间 (PDT) 进行了监测，以确保细胞库的一致性（图 2）。
图 1. 采用 HyClone™ peak expression 培养基直接对 HEK 293 细胞进行驯化。
图 2. 将多个用第 5 代传代细胞建立的细胞库冻存管解冻后，对细胞进行 VCD 和 PDT 监测。
摇瓶中的高密度培养
在本实验中，我们在摇瓶中用 HyClone™ peak expression 培养基培养了不同代次的细胞，培养时间长达 13 天（图 3）。对 VCD、细胞活力和 PDT 进行全程监测。我们可以从图 3 中看出，HyClone™ peak expression 培养基支持的细胞生长密度范围在 6.0 至 9.0 × 106 个细胞/mL 之间。
图 3. 摇瓶中的高密度细胞培养 (A)，解冻后的细胞培养 (B)，第 3 代和第 8 代细胞培养 (C)。
在摇瓶中进行瞬时转染优化
采用三重质粒转染法对已驯化的 HEK293.2 悬浮细胞进行瞬时转染。在该过程中，线性化聚乙烯亚胺 (PEI) 与 DNA 形成复合物，然后被导入到宿主细胞中。使用绿色荧光蛋白 (rAAV5-GFP) 对摇瓶中的 HEK293.2.sus细胞进行转染，质粒的使用量为 每2 × 106个细胞对应 2 μg DNA。
为研究该培养基对 PEI-DNA 复合物稳定性的影响，测试了转染复合物在HyClone™ peak expression 培养基中的占比（占rAAV生产总体积的5% 或10%）（图 4）。每种条件按三次重复在摇瓶中进行实验。结果显示 占比为10% 时，一致性较好，因此在使用 HyClone™ peak expression 培养基的 HEK293.2 细胞 rAAV 生产实验中，推荐使用该体积。
图 4. 使用 HyClone™ peak expression 培养基比较不同体积 PEI 和 DNA 复合物（5% 和 10%）在摇瓶中的转染收率差异。基因组拷贝数 = GC。
对两种培养基的基因组拷贝收率进行比较
我们评估了 rAAV5 在两种不同培养基（HyClone™ peak expression 培养基和 BalanCD™ HEK293 培养基 (Fujifilm Irvine Scientific)）中的产率。滴度测定结果以 GC/L（基因组拷贝数/升）为单位，对四次重复实验进行比较。
我们发现与 BalanCD™ 培养基相比，使用 HyClone™ peak expression 培养基时的滴度 (GC/L) 增长至 4 倍 (p < 0.05)，如图 5 所示。使用 BalanCD™ 培养基时的收率（GC/细胞）为 2.6 × 104 GC/细胞，而在使用 HyClone™ peak expression 培养基的样品中，我们观察到收率为 6.8 × 104 GC/细胞，相当于增长至两倍多，未显示相关数据。
图 5. 比较 rAAV5-GFP 生产过程中使用 HyClone™ peak expression 培养基和 BalanCD™ HEK 293 培养基所获得的基因组拷贝收率 (n = 4, p < 0.01)。采用 Student t 检验进行统计学评估。
在生物反应器中放大 rAAV5 生产
最后，我们将 rAAV5-GFP 的生产进行了放大，由摇瓶培养改为用 10 L 规格的 Xcellerex™ XDR-10 生物反应器培养，然后用 200 L 规格的 XDR-200 生物反应器进一步放大培养（图 6）。结果显示，虽然与摇瓶培养的产率稍有下降，但总体来说该工艺可在 10 L 至 200 L 生物反应器之间进行放大。GFP 的百分比峰值出现在转染后第 48 小时（2 天，未显示相关数据）。
图 6. 使用 (A) XDR-10 生物反应器在 10 L 培养规格中生产 rAAV5-GFP 生产以及使用 (B) XDR-200 生物反应器在 200 L 培养规格中生产 rAAV5-GFP。
培养基中的 DNA-PEI 复合物
为避免聚集，对抗剪切损伤，并促进悬浮培养的细胞生长，通常在生长培养基中使用泊洛沙姆。尽管收率没有显著的统计学差异，我们仍然发现，在 PEI 和 DNA 复合物中未添加 Pluronic™ F-68 的情况下，rAAV 产率低于 1.8 × 1014 GC/L，反之，rAAV 产率高于 1.8 × 1014 GC/L。（图 7）。
图 7. Pluronic™ F-68 对 rAAV 病毒滴度的影响。
结论
我们对于 HyClone™ peak expression 培养基的观察结果如下：
- HyClone™ peak expression 培养基具有完整的补料成分，无需额外添加其他培养物料，因而其在重复实验中表现更稳健，可重现性更好。
- 细胞经过冷冻保存后复苏良好，培养条件稳定。
- 在摇瓶中的高密度培养可达到 9.0 × 106 个细胞，可以进行 rAAV 批量生产。
- 采用 HyClone™ peak expression 培养基可以将工艺规模从摇瓶放大至 200 L。
- 我们发现，与 BalanCD™ HEK293 培养基相比，rAAV 收率增长至 4 倍。
- 当占生产体积 10% 时 DNA-PEI 复合物一致性较好。
- 泊洛沙姆对 DNA-PEI 复合物的效果没有影响。
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参考文献
(1) Mueller, C, Flotte, TR, Clinical gene therapy using recombinant adeno-associated virus vectors. Gene Ther. 2008;15(11):858-863. doi:10.1038/gt.2008.68
(2) Flotte, T, Gene therapy progress and prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Ther. 2004;11:805-810. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302233
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