本文借鉴了美国基因与细胞疗法学会 (ASGCT) 2021 年年会上的工具和技术演示文稿。
腺相关病毒 (AAV) 是一种常见的基因治疗载体，通常使用纯化非常小的重组蛋白的层析填料进行纯化。亲和捕获的处理时间通常很长，因此通常需要通过切向流过滤 (TFF) 进行浓缩。Fibro 层析技术具有电纺过滤器的开放结构，可实现高流速和高结合载量。这些特性使其具有高效的 AAV 捕获能力。在本研究中，我们和一家生物制造商出于此目的对 Fibro 原型进行了评估。我们发现，停留时间快可以大大缩短处理时间，并且回收和纯化性能与亲和填料相似。此外，Fibro 技术有可能消除对 TFF 的需求并适用于现有的层析系统。
AAV 载体在基因疗法中的使用
AAV 一类病毒载体是一种先进疗法制品 (ATMP)。基因疗法发展速度非常快，正在开展的临床试验已达数百项；AAV 是最重要的载体之一，尤其是在体内应用方面更是如此。该领域吸引了大量投资，许多制药公司在想方设法将此类疗法推向市场。因此，我们面临的情况是需要在全球范围扩大产能。但是，为了能让广大的患者群体用上这些新的基因疗法，并扩大在全球范围内的可及性，我们需要进行工艺强化，从而降低基因疗法的生产成本。工艺强化的实质是解决工艺流程中的痛点问题，如图 1 所示的一些痛点。
AAV 纯化的现状
图 1 显示 AAV 生产流程中的关键中游和亲和捕获步骤。
在下游工艺中，AAV 滴度相对较低。这意味着需要使用加大（即大于平常尺寸）的亲和层析柱，以确保在合理的时间范围内处理大体积的生物反应器液体。即便使用大层析柱，AAV 亲和层析时间仍然可能需要长达 24 小时，此时可选择浓缩补料来缩短该步骤的时间。但浓缩步骤可能需要 12 至 24 小时，并且会对总回收率带来不利影响。
利用 Fibro 技术解决中游和亲和性痛点
Fibro 技术是一种由电纺纤维制成的纤维素基材料，可以帮助解决浓缩和捕获步骤的痛点问题。该技术可实现高流速和高结合载量，我们 2020 年推出的用于 mAb 捕获的 Fibro PrismA 单元就证明了这一点。图 2 所示为 ATMP 处理的优点，其中包括直径较大的分子，如病毒载体和 mRNA。
图 2. Fibro 层析与填料层析中分子大小对结合载量的影响对比。
y 轴为结合载量，x 轴为靶分子大小。蛋白质等相对较小的靶分子位于左侧，沿 x 轴向右分子大小随之增加。绿线表示传统的填料层析。填料技术与载量下降有关，靶分子越大，这种情况越明显。载量下降是因为大的病毒及其他生物分子无法与填料上衍生的所有配基结合。病毒及其他大分子无法进入所有的小孔。
Fibro 层析技术使用的基质具有更开放的结构。这意味着大多数衍生配基可以结合大分子。对于病毒载体等较大的分子，Fibro 的载量比填料层析柱的载量要高。该特点加上开放结构的优点，意味着结合不用依赖于扩散。因此病毒扩散到层析微珠中不需要时间。这意味着 Fibro 的停留时间以秒为单位，而不是以分钟为单位。
图 3 所示为使用 Fibro 原型单元进行 AAV5 捕获的示例。
图 3. 使用 AAV 粘合剂衍生的 0.4 mL Fibro 原的 AAV5 捕获步骤层析图示例。NFF 为死端过滤。TFF 为切向流过滤。
根据我们的测试结果，用 AAV 粘合剂衍生的 0.4 mL 原型的载量通常为 1–4 × 1014 个衣壳/mL。此类评估中使用的停留时间在 1 至 5 秒的范围内。从图 3 可以看出，尽管流速很高，但上样阶段（本示例中大约需要 20 分钟）的压力均匀。我们的测试结果表明，使用 0.4 mL Fibro 单元在 1 至 2 小时内可捕获多达 1 L 的收获物补料，具体取决于所用的收获物补料。杂质减少率（宿主细胞蛋白质和 DNA 均达到 99%）和回收率（60% 至 90%）与我们通常用层析填料进行 AAV 捕获的情况相似。
AAV5 纯化的生物制造商案例研究
Fibro 中游采用的方法与填料采用的方法类似。我们在测试新补料时，通常会从死端过滤 (NFF) 开始。如果上样过程中压力增加，可以增加一个不带电荷的深度过滤步骤。对于难处理的补料，需要增加带电荷的深层过滤器，或者进行更高级的澄清，例如同时使用深度过滤器和普通过滤器进行沉淀。
为了确保外部补料也可以采用这种澄清方法，我们让合作方对 Fibro 原型进行了评估。图 4 和图 5 所示为来自中国信念医药科技（苏州）有限公司的一位合作者 Du Zengmin 教授提供的数据。
图 4. 澄清的 AAV5 样品，用 AAV 粘合剂衍生的 0.4 mL Fibro 原型亲和捕获所得。数据由信念医药科技（苏州）有限公司提供。
对于图 4 中的层析图，AAV5 补料先用不带电荷的深层过滤器进行过滤，然后用 0.2 μm 普通流量过滤器澄清。与亲和填料相比，使用这种澄清方法停留时间以秒计，并且上样时间显著缩短。回收率 > 80%，纯化性能与相应填料类似。尽管上样时的停留时间为 2.4 秒，但流速有限，这意味着该 400 μL 原型的运行流速约为 10 mL/min。
图 5 所示为使用 Fibro 原型捕获预纯化 AAV5 样品的层析图。
图 5. 预纯化的 AAV5 样品，用 AAV 粘合剂衍生的 0.4 mL Fibro 原型亲和捕获所得。数据由信念医药科技（苏州）有限公司提供。
该预纯化样品的压力曲线与澄清样品的曲线相似，这表明有希望扩大方案的规模。此外，如果滴度较低，样品体积将超过之前显示的 500 体积。图 5 中 Fibro 上样的体积为 625，但这仍未达到原型的最大载量。
Fibro 可在较短的停留时间内实现高结合载量
图 6 显示了 AAV 捕获的纤维层析和填料层析之间的差异。
图 6. Fibro 和 AAV 亲和填料的动态结合载量与停留时间表。
y 轴为动态结合载量，x 轴为停留时间。使用 Fibro 进行 AAV 捕获的停留时间不到一分钟。但使用填料进行层析时的停留时间低于一分钟的情况并不常见。尽管停留时间较短，但我们的实验表明，Fibro 的结合载量大约是填料的两倍。
总之，我们发现 Fibro 层析技术可以显著缩短亲和捕获步骤的处理时间。此外，上样时间快意味着有机会去除 TFF 浓度。根据我们的经验，去除 TFF 不需要对澄清方法进行任何重大改造。纤维的 AAV 捕获性能在杂质减少和回收方面与填料相似。最后，Fibro 是一个预装单元，易于设置并适配现有的仪器设备，如图 7 所示。
图 7. 预装的 Fibro 单元可轻松安装在填料层析所使用的 ÄKTA 层析系统上。
鸣谢
我们衷心感谢信念医药科技（苏州）有限公司的 Du Zengmin 教授对我们的原型进行评估并允许我们发布其数据。